Búsqueda de potenciales agentes quimioterápicos para los trastornos del espectro autista (TEA) utilizando Caenorhabditis elegans como modelo de estudio

Abstract

El sistema nervioso (SN) es el principal centro de coordinación y regulación en los animales, responsable tanto de las funciones voluntarias, como el movimiento y el comportamiento, como de las funciones autónomas, tales como la respiración, la digestión y el control del ritmo cardíaco, además de procesos sofisticados tales como la percepción, la memoria y el aprendizaje. Su desarrollo es un proceso complejo que incluye proliferación celular, diferenciación y sinaptogénesis. Las fallas durante este proceso pueden acarrear consecuencias leves o severas, y pueden conducir a diversos fenotipos neurológicos denominados comúnmente desórdenes del neurodesarrollo (DND). Entre ellos, el Trastorno del Espectro Autista (TEA), es uno de los DND más prevalentes, afectando a más del 2% de la población. Este tipo de trastornos es típicamente de origen multifactorial, entre los que se destacan factores genéticos, epigenéticos y ambientales. Entre la enorme batería de genes cuyas mutaciones aumentan enormemente la probabilidad de desarrollar TEA se encuentra PTEN. Típicamente vinculadas con la aparición de tumores, las mutaciones en PTEN han sido vinculadas cada vez más con la aparición de DND, incluyendo TEA, macrocefalia y otros fenotipos neuropsiquiátricos. A pesar de la enorme evidencia que indica la correlación entre estas mutaciones y el desarrollo del TEA, no se conocen con precisión los mecanismos moleculares por los cuales las fallas en este gen terminan comprometiendo los procesos normales del neurodesarrollo. En lo que respecta a tratamientos para el TEA (y en general para varios DND), no existen abordajes terapéuticos que hayan demostrado altos niveles de eficacia en la mejora de los síntomas centrales como dificultades en la comunicación y patrones de comportamiento repetitivos.

Actualmente, las estrategias terapéuticas se enfocan principalmente en intervenciones educativas y conductuales para mejorar la calidad de vida de los pacientes y sus familias, y medicamentos para manejar las comorbilidades. En los últimos años, ha surgido un creciente interés en las dietas cetogénicas (DCs) como una herramienta terapéutica promisoria. Este tipo de regímenes alimentarios, caracterizados por una ingesta baja de carbohidratos, moderada de proteínas y alta de grasas, han sido utilizados con relativo éxito en algunos pacientes con epilepsia refractaria. Existe evidencia, además, que la DC es también capaz de revertir endofenotipos del TEA en humanos y en modelos murinos inducidos por ácido valproico. Al igual que la restricción dietaria, la DC induce un estado de cetosis en la que se producen los metabolitos acetona, acetoacetato y β-Hidroxibutirato (βHB), denominados comúnmente cuerpos cetónicos (CCs). Estos compuestos, además de servir como fuente alternativa de energía a la glucosa, podrían desempeñar un papel crucial en la regulación de procesos celulares alterados en el TEA. Sin embargo, el mecanismo molecular que subyace a los beneficios de la DC y los CCs está aún lejos de ser dilucidado. Resulta evidente entonces, que, para la creación de estrategias terapéuticas eficientes, es imperante avanzar en el conocimiento biológico fundamental que subyace a este tipo de desórdenes. Una de las mayores barreras que históricamente dificultó las disciplinas que abordan el estudio del SN, es la extrema complejidad que este sistema tiene en los mamíferos. En este contexto, el surgimiento de Caenorhabditis elegans como modelo de investigación ha sido fundamental para el avance de diversas disciplinas científicas. La simplicidad de su SN, junto con el rápido ciclo de vida que lo caracteriza y la facilidad para realizar manipulaciones genéticas y ensayos farmacológicos, han permitido lograr avances significativos en los campos de la neurobiología, biología del desarrollo y otras áreas de la biomedicina. Además, su pequeño tamaño y la capacidad de generar un gran número de individuos en poco tiempo facilitan estudios de gran escala, haciéndolo una plataforma versátil y económica para la investigación científica. En la presente tesis, nos propusimos explorar las bases moleculares subyacentes a las disfunciones del neurodesarrollo utilizando C. elegans como modelo. Específicamente, se buscó dilucidar los eventos celulares y moleculares asociados a la mutación del gen daf-18 (homólogo de PTEN en C. elegans) y evaluar las consecuencias funcionales de estas mutaciones. Adicionalmente, abordamos una estrategia farmacológica que busca revertir los fenotipos alterados, basándonos fundamentalmente en los CCs y las investigaciones previas que reportan el potencial de los mismos en el mejoramiento de numerosas funciones biológicas.

En la primera sección, nos propusimos estudiar la vía PI3K/AKT/FOXO. Esta vía se encuentra altamente conservada y presenta sus respectivos homólogos en C. elegans, como daf-18 (homólogo de PTEN) y daf-16 (homólogo de FOXO, una importantísima familia de factores de transcripción), entre otros. Como un abordaje inicial, evaluamos los fenómenos asociados a la pérdida de función de este gen, fundamentalmente sobre el desarrollo del SN y sus consecuencias funcionales. Se ha postulado que una característica frecuente en individuos con diversos trastornos neurológicos es la presencia de un desequilibrio entre los sistemas de señalización excitatorios e inhibitorios (E/I), hacia una mayor preponderancia del sistema excitatorio. A diferencia de lo que ocurre en humanos, en C. elegans existe, a nivel de las uniones neuromusculares, tanto señalización GABAérgica inhibitoria como colinérgica excitatoria, lo que permite el uso de este modelo nematode como una plataforma para el estudio del balance E/I. Alteraciones en este equilibrio pueden desencadenar fenotipos de movimiento, así como diferentes sensibilidades a compuestos moduladores de dichos sistemas. En base a ello, y como una primera aproximación, realizamos ensayos con los fármacos estimulantes del sistema colinérgico excitatorio aldicarb y levamisol, los cuales poseen un poder predictivo validado para la evaluación funcional de dichos sistemas. Los resultados de estos ensayos demostraron que mutantes daf-18 y daf-16 presentan una hipersensibilidad a los mismos, sugiriendo un posible desbalance entre los sistemas neuromotores E/I. Adicionalmente, en estos mutantes, encontramos otros fenotipos neuromotores fuertemente vinculados a deficiencias E/I, como un acortamiento excesivo de la longitud corporal luego de la estimulación mecánica en la región anterior, y una menor proporción de giros en omega cerrados durante la respuesta de escape. Más aún, mediante optogenética, observamos que la activación de neuronas GABAérgicas, tanto en animales daf- 18 como daf-16, resultó en un alargamiento del cuerpo de menor magnitud a la observada en animales salvajes. Por otro lado, la estimulación neuronal colinérgica en estos mutantes produjo una contracción exagerada del cuerpo. Al analizar el estado morfológico de las motoneuronas mediante reporteros fluorescentes, pudimos comprobar que tanto mutantes daf-18 como daf- 16 presentan defectos morfológicos en comisuras de neuronas tipo D pertenecientes al sistema GABAérgico, pero no así defectos evidentes en comisuras del sistema colinérgico. Estas aberraciones son visibles ya en el primer estadio larval L1, y son parcialmente rescatadas por la expresión específica de daf-18 en neuronas GABAérgicas. Estos defectos morfológicos en motoneuronas GABAérgicas, presentes desde estadios muy tempranos del desarrollo, sugieren que mutaciones en estos genes podrían estar comprometiendo el neurodesarrollo y consecuentemente ocasionando fenotipos locomotores como los observados. Dado que daf-18

modula negativamente la vía de señalización similar a insulina (es decir, la vía ILPs/AGE-1/AKT, homóloga a la vía insulina/PI3K/AKT en mamíferos), la pérdida de función de daf-18 afecta la actividad del factor de transcripción DAF-16. Nuestros resultados revelaron que todos los fenotipos observados están también presentes en mutantes daf-16 en similar magnitud, tanto en mutantes simples como en dobles. Los fenotipos alterados, no fueron observados, en cambio, en mutantes de genes clave para otras vías íntimamente relacionadas con daf-18¸ como la vía de TOR. Esto es indicativo de que la mayoría de los fenotipos alterados podrían deberse a la disminución de la funcionalidad del factor de transcripción DAF-16, producto de la pérdida de función de daf-18. En la segunda sección nos propusimos abordar el estudio de los efectos de los CCs, específicamente el βHB, por su posible valor terapéutico para el tratamiento de ciertos desórdenes que involucran al SN. Resulta destacable que el βHB, el principal CC bajo DC y restricción dietaria, ha demostrado mejorar numerosos indicadores en C. elegans, como la resistencia al estrés, termotolerancia, longevidad, así como también disminución de agregados proteotóxicos en modelos de Parkinson y Alzheimer. Más interesante aún, es que entre los mecanismos de acción propuestos para los beneficios del βHB se encuentra su potencial para aumentar la actividad de FOXO, y el consecuente aumento de la expresión de numerosos genes citoprotectores. Este escenario resulta promisorio para el uso de este compuesto en aquellos casos en los que FOXO presenta baja actividad por mutaciones que modulan positivamente la vía PI3K/AKT, vía que regula negativamente la actividad de este factor de transcripción. Observamos que la incubación previa con βHB durante todo el desarrollo mejoró el fenotipo de acortamiento excesivo en la respuesta de escape ante un estímulo mecánico, así como también el de hipersensibilidad a los fármacos estimulantes de la actividad colinérgica aldicarb y levamisol en mutantes daf-18. Adicionalmente, pudimos comprobar que el βHB rescata los fenotipos de sobrealargamiento e hipercontracción tras la estimulación optogenética en los sistemas GABAérgico y colinérgico, respectivamente. La exposición a βHB también logró aumentar el porcentaje de giros en omega cerrados durante la respuesta de escape tras la estimulación mecánica en daf-18, y de reducir de manera significativa los defectos morfológicos de las motoneuronas GABAérgica. Dado que ninguna de estas mejoras fueron observadas en mutantes daf-16 o dobles mutantes daf-18;daf-16, nuestros resultados indican que los beneficios obtenidos mediante la exposición a este metabolito podrían explicarse por su capacidad de modular la actividad del factor de transcripción DAF-16. Finalmente, pudimos determinar que existe una etapa crítica para observar los efectos beneficiosos del βHB. Mediante exposiciones en diversas ventanas

temporales comprobamos que una breve exposición al βHB durante el desarrollo temprano fue suficiente para revertir varios de estos fenotipos, mientras que exposiciones tardías no mostraron dichos beneficios. En conjunto, los resultados de la presente tesis demuestran el enorme potencial del uso del modelo C. elegans como una plataforma eficiente para el estudio de aquellas mutaciones que comprometen el neurodesarrollo. Los fenotipos descriptos pueden servir como base para la elaboración de flujos de trabajo que apunten a la evaluación de compuestos con potencial terapéutico. Además, los resultados obtenidos constituyen un paso clave hacia la comprensión de los mecanismos de acción de los CCs, fundamentalmente del βHB, y su posible uso en trastornos asociados con mutaciones en genes claves de la vía de PI3K/AKT/FOXO, enormemente implicada en los procesos de neurodesarrollo.

The nervous system (NS) is the primary center for coordination and regulation in animals, responsible for both voluntary functions, such as movement and behavior, and autonomic functions, such as breathing, digestion, and heart rate control, as well as sophisticated processes such as perception, memory, and learning. Its development is a complex process that includes cell proliferation, differentiation, and synaptogenesis. Failures during this process can lead to mild or severe consequences and may result in various neurological phenotypes commonly referred to as neurodevelopmental disorders (NDDs). Among these, Autism Spectrum Disorder (ASD) is one of the most prevalent NDDs, affecting over 2% of the population. This type of disorder is typically multifactorial, involving genetic, epigenetic, and environmental factors. Among the vast array of genes whose mutations greatly increase the likelihood of developing ASD is PTEN. Typically associated with tumor development, PTEN mutations have been increasingly linked to the emergence of NDDs, including ASD, macrocephaly, and other neuropsychiatric phenotypes. Despite the overwhelming evidence indicating a correlation between these mutations and ASD development, the molecular mechanisms through which PTEN dysfunction compromises normal neurodevelopment remain unclear. Regarding treatments for ASD (and many other NDDs), there are no therapeutic approaches that have demonstrated high efficacy in improving core symptoms, such as communication difficulties and repetitive behavior patterns. Current therapeutic strategies primarily focus on educational and behavioral interventions to improve patients’ and families’ quality of life, as well as medications to manage comorbidities.

In recent years, ketogenic diets (KDs) have garnered growing interest as a promising therapeutic tool. These dietary regimens, characterized by low carbohydrate and high fat and protein intake, have been used with relative success in some patients with refractory epilepsy. Moreover, evidence suggests that KDs can also reverse ASD endophenotypes in humans and valproic acid- induced murine models. Like dietary restriction, KDs induce a state of ketosis in which the metabolites acetone, acetoacetate, and β-hydroxybutyrate (βHB)—commonly known as ketone bodies (KBs)—are produced. These compounds, besides serving as an alternative energy source to glucose, may play a crucial role in regulating cellular processes altered in ASD. However, the molecular mechanisms underlying the benefits of KDs and KBs remain far from elucidated. It is thus evident that advancing fundamental biological knowledge of these disorders is imperative for the development of effective therapeutic strategies. One of the greatest historical barriers to disciplines addressing the study of the NS is the extreme complexity of this system in mammals. In this context, the emergence of Caenorhabditis elegans as a research model has been pivotal for advancements in various scientific disciplines. The simplicity of its NS, combined with its rapid life cycle, and the ease of performing genetic manipulations and pharmacological assays, has enabled significant progress in the fields of neurobiology, developmental biology, and other areas of biomedicine. Furthermore, its small size and the ability to generate a large number of individuals in a short time facilitate large-scale studies, making it a versatile and cost-effective platform for scientific research. In this thesis, we aimed to explore the molecular bases underlying neurodevelopmental dysfunctions using C. elegans as a model. Specifically, we sought to elucidate the cellular and molecular events associated with mutations in the daf-18 gene (C. elegans homolog of PTEN) and to evaluate the functional consequences of these mutations. Additionally, we investigated a pharmacological strategy aimed at reversing altered phenotypes, focusing primarily on KBs and prior research reporting their potential to improve numerous biological functions. In the first section, we studied the PI3K/Akt/FOXO pathway. This pathway is highly conserved and has its respective homologs in C. elegans, such as daf-18 (PTEN homolog) and daf-16 (FOXO homolog, a crucial family of transcription factors), among others. As an initial approach, we evaluated phenomena associated with the loss of function of this gene, focusing on NS development and its functional consequences. It has been proposed that a common characteristic in individuals with various neurological disorders is an imbalance in excitatory and inhibitory signaling systems (E/I), favoring excitatory signaling. Unlike humans, C. elegans exhibits both inhibitory GABAergic and excitatory

cholinergic signaling at the neuromuscular junctions, making this nematode model a platform for studying the E/I balance. Alterations in this balance can trigger locomotion phenotypes and varying sensitivities to compounds modulating these systems. Based on this, and as an initial approach, we conducted assays with excitatory cholinergic system stimulants aldicarb and levamisole, validated predictive tools for functional evaluation of these systems. Results from these assays showed that daf-18 and daf-16 mutants exhibit hypersensitivity to these compounds, suggesting a possible imbalance in E/I neuromotor systems. Additionally, in these mutants, we identified other neuromotor phenotypes strongly linked to E/I deficiencies, such as excessive body shortening following anterior mechanical stimulation and a lower proportion of closed omega turns during escape responses. Furthermore, optogenetic activation of GABAergic neurons in daf-18 and daf-16 mutants resulted in less pronounced body elongation compared to wild-type animals. Conversely, cholinergic neuronal stimulation in these mutants caused exaggerated body contraction. Morphological analysis of motoneurons using fluorescent reporters revealed defects in commissures of D-type GABAergic neurons in both daf-18 and daf- 16 mutants, but no evident defects in cholinergic system commissures. These abnormalities are visible as early as the L1 larval stage and are partially rescued by the specific expression of daf- 18 in GABAergic neurons. These morphological defects in GABAergic motoneurons, present from very early developmental stages, suggest that mutations in these genes may compromise neurodevelopment and consequently lead to the observed locomotor phenotypes. Since daf-18 negatively modulates the insulin-like signaling pathway (i.e., the ILPs/AGE-1/AKT pathway, homologous to the insulin/PI3K/AKT pathway in mammals), the loss of daf-18 function affects the activity of the transcription factor DAF-16. Our results revealed that all observed phenotypes are also present in daf-16 mutants to a similar extent, in both single and double mutants. However, the altered phenotypes were not observed in mutants of key genes in other pathways closely related to daf-18, such as the TOR pathway. This suggests that most altered phenotypes may be due to reduced functionality of the DAF-16 transcription factor, resulting from the loss of daf-18 function. In the second section, we studied the effects of KBs, specifically βHB, due to its potential therapeutic value for treating certain NS-related disorders. Remarkably, βHB—the main KB under KD and dietary restriction—has been shown to improve numerous indicators in C. elegans, such as stress resistance, thermotolerance, longevity, and reduction of proteotoxic aggregates in Parkinson’s and Alzheimer’s models. Even more intriguing is that one proposed mechanism of action for βHB’s benefits is its potential to enhance FOXO activity, consequently increasing the expression of numerous cytoprotective genes. This scenario is promising for using

this compound in cases where FOXO activity is reduced due to mutations that positively regulate the PI3K/AKT pathway, which negatively regulates this transcription factor. We observed that prior incubation with βHB throughout development improved the phenotype of excessive shortening during the escape response to mechanical stimuli, as well as hypersensitivity to the cholinergic activity stimulants aldicarb and levamisole in daf-18 mutants. Additionally, βHB exposure rescued the overelongation and hypercontraction phenotypes following optogenetic stimulation of GABAergic and cholinergic systems, respectively. βHB also increased the percentage of closed omega turns during the escape response to mechanical stimulation in daf-18 mutants and significantly reduced morphological defects in GABAergic motoneurons. Since none of these improvements were observed in daf-16 mutants or daf- 18;daf-16 double mutants, our results suggest that the benefits obtained through exposure to this metabolite may be explained by its ability to modulate DAF-16 transcription factor activity. Finally, we determined a critical period for observing βHB’s beneficial effects. Through exposure during various temporal windows, we found that brief early developmental exposure to βHB was sufficient to reverse several phenotypes, whereas late exposures did not yield such benefits. Together, the results of this thesis demonstrate the enormous potential of C. elegans as an efficient platform for studying mutations that compromise neurodevelopment. The described phenotypes may serve as a foundation for developing workflows aimed at evaluating compounds with therapeutic potential. Furthermore, the findings represent a key step toward understanding the mechanisms of action of KBs, primarily βHB, and their potential use in disorders associated with mutations in key genes of the PI3K/AKT/FOXO pathway, which is heavily implicated in neurodevelopmental processes.