Aislamiento y caracterización fenotípica de cepas silvestres de Caenorhabditis elegans

Abstract

A lo largo de la historia, las ciencias biológicas se han valido de la utilización de distintos organismos vertebrados e invertebrados para identificar mecanismos y procesos fundamentales, muchos de los cuales terminaron teniendo una gran implicancia biomédica. Uno de los modelos invertebrados más utilizados en los últimos 35 años es el nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans. Este pequeño gusano (1 mm de longitud en estadio adulto), ha sido encontrado en diversas regiones del planeta y presenta varias ventajas para realizar estudios biológicos. Por ejemplo, C. elegans se puede cultivar fácilmente en el laboratorio utilizando bacterias como fuente de alimento, tiene un ciclo de vida corto(3-4 días), produce ∼300 larvas por generación y puede ser almacenado a -80℃ indefinidamente. Además, tiene un cuerpo transparente que permite la observación directa de sus órganos internos por microscopia de contraste de interferencia Nomarsky y la visualización de células específicas y procesos fisiológicos in vivo utilizando reporteros fluorescentes. El genoma de C. elegans fue el primero en ser completamente secuenciado. La disponibilidad de herramientas genéticas y experimentales han permitido importantes logros, tales como el mapeo del linaje celular de las 959 células somáticas del hermafrodita y un diagrama completo de cada una de las conexiones del sistema nervioso. A su vez, estudios en este organismo han contribuido al entendimiento de procesos cruciales altamente conservados tales como la interferencia por ARN, el fenómeno de apoptosis, las vías de la insulina, las bases moleculares del envejecimiento, la fisiología del estrés, por citar algunos. Más allá de la indiscutible relevancia de la utilización de este nematodo en ciencias biológicas y biomédicas, es necesario remarcar que la mayor parte de estos descubrimientos han procedido del uso de una única cepa adaptada al laboratorio desde 1963, proveniente de Bristol, Inglaterra, conocida comoN2. Dado que sólo se ha estudiado extensamente un único fondo genético, tenemos mucho más que aprender utilizando la diversidad natural de esta especie. Con el advenimiento de las técnicas de secuenciación a principios de este siglo, se reveló que cepas de C. elegans aisladas en otras regiones del mundo (en particular la cepa CB4856, aislada en Hawái) poseen un gran número de polimorfismos de nucleótido único (SNP por Single Nucleotide Polimorphism) en relación a la cepa estándar de laboratorio N2. La comparación de los SNPs entre estas cepas ha facilitado de manera decisiva el mapeo de genes involucrados en diversos procesos biológicos. A su vez, en los últimos años el análisis de cepas salvajes ha permitido el estudio de procesos moleculares que subyacen a distintos fenotipos que son difíciles de observar en la cepa estándar de laboratorio N2. Esto demuestra la importancia de conocer y estudiar nuevas cepas silvestres. Con este objetivo, nos propusimos la recolección, identificación, y caracterización de una cepa de C. elegans argentina. Al día de hoy, sólo el 1,2% de todos los C. elegans aislados en el mundo corresponden a cepas silvestres sudamericanas y, más aún, ninguna de estas cepas fueron aisladas en nuestro país (https://www.elegansvariation.org/strain/globalstrain-map).En nuestro trabajo aislamos distintas especies de nematodos a partir de muestras de suelo de la región. En una primera instancia, acotamos el número de individuos recolectados observando y comparando características típicas del nematodo Caenorhabditis elegans. Estas incluyen el tamaño, estrategia de reproducción, movimiento, morfología faríngea y velocidad de crecimiento. Además, agregamos información molecular realizando, en aquella cepa que pasó el primer filtro de selección, un análisis por PCR para identificar amplicones específicos de C. elegans. Finalmente, confirmamos mediante cruzas genéticas el aislamiento de una cepa de C. elegans argentina a la que denominamos OAR137.Continuamos la investigación realizando una primera caracterización fenotípica base de la cepa. Hemos encontrado diferencias significativas en varios parámetros de locomoción, desarrollo, y resistencia a estrés oxidativo entre la cepa salvaje aislada por nosotros y la cepa de laboratorio N2. En primer lugar,la velocidad de movimiento en líquido de la cepa aislada en Argentina (OAR137) es significativamente mayor que la cepa de laboratorio N2. Este resultado, sumado a que la cepa OAR137 es más resistente ala acción paralizante del agonista nicotínico levamisol, sugiere diferencias importantes en la transmisión neuromuscular de ambas cepas. Además de las diferencias motoras, encontramos que los individuos deOAR137 presentan un modelo poblacional de aglutinación, con agregación social de animales (en comparación al patrón solitario y disperso característico de N2) y que dejan un menor número de descendencia. Al mismo tiempo, encontramos que la cepa salvaje OAR137 es más resistentes al estrés oxidativo en relación a la cepa de laboratorio N2. Esto último puede estar sugiriendo la existencia en la naturaleza de una compensación o “trade-off” entre la reproducción y la resistencia a estresantes. Este trabajo de tesis constituye el primer paso para identificar las bases moleculares de las diferencias fenotípicas observadas en la locomoción y, a su vez, para explorar otros fenotipos diferenciales con respecto a la cepa estándar de laboratorio. Para ello, ya hemos enviado a secuenciar el genoma de nuestra cepa, con el objetivo (que excede los alcances de este trabajo de tesis) de identificar los genes involucrados en las diferencias observadas. A su vez, con nuestra identificación de la primera cepa argentina de C. elegans contribuimos al esfuerzo global destinado a explotar la variabilidad natural de esta especie en el entendimiento de procesos biológicos fundamentales. Dada la conservación de estos procesos en todo el reino animal, este estudio podría aportar a la comprensión universal de diversos mecanismos, tales como la transmisión neuromuscular.