Propiedades funcionales y farmacológicas de receptores Cys-loop de serotonina humano y del nematodo Caenorhabditis elegans : búsqueda de nuevos fármacos

Abstract

El sistema nervioso consiste en una red muy compleja de billones de neuronas que se comunican entre sí. Las sinapsis químicas son primordiales para la comunicación neuronal rápida y eficiente, y están mediadas por la liberación de neurotransmisores a la hendidura sináptica para unirse a sus receptores específicos ubicados en otras células o neuronas postsinápticas. Entre los receptores de neurotransmisores se encuentran los receptores Cys-loop, que pertenecen a la superfamilia de canales pentaméricos activados por ligando (pLGIC). Son proteínas integrales de membrana que convierten la señal química en una respuesta eléctrica al permitir el paso de iones de un lado a otro de la membrana. Estos receptores se constituyen por 3 regiones fundamentales, el dominio extracelular, donde se encuentra el sitio de unión del neurotransmisor o sitio ortostérico; el dominio transmembrana, que conforma el poro del canal y contiene los sitios de unión para diferentes moduladores alostéricos; y el dominio intracelular que posee sitios de modulación y aminoácidos determinantes de la conductancia del canal. En vertebrados, esta familia de receptores está formada por los receptores nicotínicos de acetilcolina y el receptor de serotonina tipo 3 (5-HT3), los cuales son permeables a cationes, y por los receptores de ácido γ-aminobutírico tipo A (GABAA) y receptores de glicina, permeables a aniones. El repertorio de receptores Cys-loop en invertebrados es más variado y extenso, incluyendo entre ellos un canal aniónico activado por serotonina, denominado MOD-1. Los receptores Cys-loop son ampliamente estudiados por ser blancos moleculares terapéuticos en una extensa variedad de patologías. Es por ello por lo que ampliar el conocimiento de la función y modulación de estos receptores permitirá generar mejores estrategias farmacológicas. En esta Tesis Doctoral se realizaron estudios de la función y modulación de los receptores Cys-loop activados por serotonina humano, 5-HT3, y de Caenorhabditis elegans, MOD-1, para la búsqueda de nuevos fármacos y la generación de estrategias de reposicionamiento de medicamentos de uso clínico. En el Capítulo 1 se estudió la funcionalidad molecular del receptor 5-HT3A humano. Se logró descifrar las diferencias entre la activación ortostérica y la activación y modulación alostérica por terpenoides, utilizando la valiosa técnica de patch-clamp. Se definieron las bases mecanísticas de la activación de 5-HT3A por los agonistas ortostéricos serotonina y triptamina, y de la activación alostérica por los terpenoides timol y carvacrol. Se demostró que triptamina es un agonista de muy baja eficacia y potencia. Mediante registros de whole-cell, se demostró que los terpenoides potencian las corrientes evocadas por serotonina, pero también poseen capacidad para evocar alostéricamente respuestas macroscópicas, con mayor potencia y eficacia que triptamina, aunque de forma más lenta que serotonina. Mediante registros de canal único, se evidenció que dichos compuestos activan al receptor 5-HT3 como agonistas muy eficaces dado que generan episodios de activación más prolongados que serotonina. Nuestro estudio mostró la primera caracterización a nivel de canal único de la activación de 5-HT3A humano por ligandos alostéricos, de creciente interés como herramientas terapéuticas. En el Capítulo 2 se halló un nuevo blanco promisorio para la terapia antihelmíntica, estudiando ampliamente al receptor MOD-1 de C. elegans. Este nematodo es un buen modelo parasitario ya que comparte las características funcionales y farmacológicas con los nematodos parasitarios. Además C. elegans es sensible a la mayoría de los fármacos antiparasitarios que están dirigidos a los receptores Cys-loop de los parásitos. Dado que MOD-1 está ausente en vertebrados, se encuentra limitado al filo, y está presente en nematodos parasíticos, emerge como un blanco farmacológico promisorio. En este capítulo se revelaron las diferencias en la selectividad agonista y en los sitios ago-PAM entre MOD-1 y el receptor de serotonina humano 5-HT3. Se encontró que la triptamina, un agonista muy parcial de 5-HT3A, es un agonista eficaz de MOD-1, y se demostró además que posee una acción antihelmíntica. Por otro lado, se realizó un testeo de una variedad de compuestos en búsqueda de nuevos moduladores de MOD- 1. Se demostró, mediante estudios electrofisiológicos, que muscimol y piperazina (PZE) son antagonistas no competitivos de MOD-1. Mediante ensayos de comportamiento en gusanos se confirmó el efecto de PZE sobre MOD-1, hallando de esta manera un nuevo blanco molecular para este fármaco de uso antiparasitario. Estos estudios ampliaron el conocimiento de receptores Cys-loop de nematodos para el descubrimiento de nuevos compuestos con actividad nematicida. Por lo tanto, se concluye que, derivados de triptamina y PZE podrían ser explorados como nuevos compuestos con potencial actividad antiparasitaria. En el Capítulo 3, se comenzó a plantear estrategias para reposicionar medicamentos de uso clínico, para lograr superar las desventajas de generar un fármaco de novo, acortando los tiempos y recursos necesarios para realizar los estudios farmacológicos, famacocinéticos y de toxicidad requeridos para la producción de nuevos fármacos dirigidos a tratar patologías en las que los receptores estudiados en esta Tesis están involucrados. Con tal fin, se exploró el efecto de fármacos de uso comercial derivados de triptamina y PZE, debido a lo postulado en el capítulo 2, y se encontró que sumatriptan, un fármaco comercializado para tratar la migraña, sería un buen candidato para reposicionar para la terapia antiparasitaria. Además, PZE podría reutilizarse como modulador alostérico negativo de los receptores 5-HT3A humano abordando patologías en las que este receptor está involucrado, tales como náuseas y vómitos relacionados a la quimioterapia, radioterapia y anestesia, así como para mitigar los síntomas del síndrome de intestino irritable y para patologías del sistema nervioso como depresión, ansiedad y esquizofrenia, entre otras en las que este receptor está involucrado. En resumen, aprovechando la potencialidad que brindan los registros de canal único y de corrientes macroscópicas en el estudio de las bases moleculares del funcionamiento y modulación de estos receptores Cys-loop, se logró hallar un nuevo blanco antiparasitario, descifrar por primera vez las diferencias de activación ortostérica y alostérica del receptor 5-HT3A humano por timol y carvacrol, y generar estrategias de reposicionamiento de fármacos de uso clínico mediante la modulación alostérica de estos receptores tanto en C. elegans como en humano. Estos estudios amplían el conocimiento de la función y modulación de los receptores Cys-loop, generando una base para abordar patologías que involucran a estos receptores y para el desarrollo de nuevos y más selectivos fármacos.

The nervous system consists of a highly complex network of billions of neurons that communicate with each other. Chemical synapses are key to the rapid and efficient neuronal communication and are mediated by the release of neurotransmitters into the synaptic cleft to bind to their specific receptors located either on other cells or postsynaptic neurons. Among the neurotransmitter receptors are the Cys-loop receptors, which belong to the superfamily of ligand-gated pentameric channels (pLGIC). They are integral membrane proteins that convert the chemical signal into an electrical response by allowing ions to pass from one side of the membrane to the other. These receptors are made up of 3 fundamental regions: the extracellular domain, where the neurotransmitter binding site or orthosteric site is located; the transmembrane domain, which forms the channel pore and contains the binding sites for different allosteric modulators; and the intracellular domain which contains modulation sites and amino acids that determine channel conductance. In vertebrates, this family of receptors consists of the nicotinic acetylcholine receptors and the serotonin receptor type 3 (5- HT3), both of which are permeable to cations, and the receptors for γ-aminobutyric acid type A (GABAA) and glycine receptors, permeable to anions. The repertoire of Cys-loop receptors in invertebrates is more varied and extensive, including among them, a serotonin-activated anion channel called MOD-1. Cys-loop receptors have been extensively studied as they are therapeutic molecular targets in a wide variety of pathologies. Expanding our knowledge on the function and modulation of these receptors will therefore contribute to generating better pharmacological strategies for the treatment of these disorders. In this Ph. D. thesis studies were carried out on the function and modulation of the Cys-loop receptors activated by human serotonin, 5-HT3, and of Caenorhabditis elegans, MOD-1, for the search for new drugs and the generation of repositioning strategies for drugs for clinical use. In Chapter 1 the molecular functionality of the human 5-HT3A receptor was studied. It was possible to decipher the differences between orthosteric activation and allosteric activation and modulation by terpenoids, using the valuable patch-clamp technique. The mechanistic bases of 5-HT3A activation by the orthosteric agonists serotonin and tryptamine, and allosteric activation by the terpenoids thymol and carvacrol, were defined. It is revealed that tryptamine is an agonist with very low efficacy and potency. Using whole-cell recordings, they show that terpenoids not only potentiate the currents evoked by serotonin but also have the ability to allosterically evoke macroscopic responses, with greater power and efficiency than tryptamine, although more slowly than serotonin. Using single channel recordings, these compounds were shown to activate the 5-HT3A receptor as highly effective agonists, since they generate longer episodes of activation than serotonin. Our study showed the first characterization at the single channel level of the activation of human 5-HT3A by allosteric ligands, of increasing interest as therapeutic tools. In Chapter 2, a promising new target for anthelmintic therapy was found by extensively studying the MOD-1 receptor of C. elegans. This nematode is a good parasitic model since it shares functional and pharmacological characteristics with parasitic nematodes. In addition, C. elegans is sensitive to most antiparasitic drugs that are directed at the Cys-loop receptors of the parasites. Since MOD-1 is absent in vertebrates, limited to the phylum, and present in parasitic nematodes, it emerges as a promising drug target. In this chapter we revealed the differences in agonist selectivity and ago-PAM sites between MOD-1 and the human serotonin 5-HT3 receptor. Tryptamine, a very partial agonist of 5-HT3A, was found to be an effective agonist of MOD-1, and was further shown to have an anthelmintic action. On the other hand, we carried out a test of a variety of compounds in search of new modulators of MOD-1. We demonstrated by means of electrophysiological studies that muscimol and piperazine (PZE) are non- competitive antagonists of MOD-1. Also, through behavioral tests in worms, we confirmed the effect of PZE on MOD-1, thus finding a new molecular target for this drug for antiparasitic use. These studies have considerably expanded the knowledge of nematode Cys-loop receptors for the discovery of new compounds with nematicidal activity. We conclude that tryptamine and PZE derivatives could be explored as new compounds with potential antiparasitic activity. In Chapter 3, we began to propose strategies to reposition drugs for clinical use in order to overcome the disadvantages of generating a new drug, shortening the time and resources necessary to perform the pharmacological, pharmacokinetic, and toxicity studies required for the production of new drugs aimed at treating pathologies in which the receptors studied in this Ph. D. thesis are involved. To this end, the effect of drugs in commercial use derived from tryptamine and PZE was explored based on the results collected in Chapter 2. It was found that sumatriptan, a drug marketed to treat migraine, appears to be a good candidate to reposition for antiparasitic therapy. In addition, PZE could be reused as a negative allosteric modulator of human 5-HT3A receptors, addressing pathologies in which this receptor is involved, such as nausea and vomiting related to chemotherapy, radiotherapy, and anesthesia, as well as to alleviate the symptoms of irritable bowel syndrome and for pathologies of the nervous system, such as depression, anxiety and schizophrenia, among others in which this receptor is involved. Summing up, taking advantage of the potential offered by single channel recordings and macroscopic currents in the study of the molecular bases of the functioning and modulation of the Cys-loop receptors explored in this Ph. D. thesis, it was possible to: i) find a new antiparasitic target, ii) to decipher for the first time the differences of orthosteric and allosteric activation of the human 5-HT3A receptor by thymol and carvacrol, and iii) to generate drug repositioning strategies for clinical use through allosteric modulation of these receptors in both C. elegans and humans. These studies broaden the knowledge of the function and modulation of Cys- loop receptors, generating a basis for addressing pathologies that involve these receptors as well as for developing new and more selective drugs.