Estudios comportamentales y farmacológicos en Caenorhabditis elegans : circuitos neuronales implicados en la alimentación

Abstract

Caenorhabditis elegans es un nematodo de vida libre utilizado para responder interrogantes biológicos generales desde hace aproximadamente 60 años. Su fácil manipulación genética, el conocimiento del conectoma completo y la sencillez para estudiar su comportamiento, lo convierten en un excelente modelo para abordar preguntas neurobiológicas fundamentales y realizar ensayos farmacológicos. En esta tesis doctoral, empleamos al nematodo C. elegans como modelo para el estudio de la modulación neuronal de conductas asociadas a la alimentación y para la búsqueda de compuestos con potencial terapéutico. Una adecuada alimentación es esencial para la supervivencia de los animales. El sistema nervioso modula la actividad motora en función de la disponibilidad de alimento en el medio ambiente y del estado nutricional interno. Cuando los animales han experimentado un ayuno prolongado y encuentran comida nuevamente, permanecen en un área pequeña para explotar al máximo la nueva fuente de nutrientes. El estímulo de comida tanto en ratones como en invertebrados produce la liberación de serotonina (5-HT). En C. elegans, la 5-HT modula comportamientos relacionados principalmente con la presencia de alimento: aumenta el bombeo faríngeo y la deposición de huevos y suprime la locomoción. Cuando C. elegans ha permanecido en ausencia de comida por un largo período y retorna al alimento, exhibe un drástico descenso de la velocidad e incrementa el bombeo faríngeo para favorecer la ingesta de comida. Se sabe que la abrupta reducción de la locomoción en el encuentro con el alimento depende de la liberación de 5-HT desde dos neuronas serotoninérgicas denominadas NSM y ADF. Por otro lado, la tiramina (TA) y octopamina (OA), análogos de noradrenalina y adrenalina en invertebrados, respectivamente, son capaces de ejercer efectos opuestos a la 5-HT reduciendo el bombeo faríngeo y la puesta de huevos. A su vez, así como la 5-HT modula comportamientos que favorecen la alimentación en presencia de comida, la OA, por el contrario, regula conductas que son importantes durante el ayuno, como por ejemplo el aumento de la locomoción para facilitar la búsqueda de alimento. Sin embargo, las acciones ejercidas por la TA con respecto a la alimentación y locomoción aún no son del todo claras. A pesar de que existen evidencias de los efectos antagónicos entre las vías serotoninérgicas y tira/octopaminérgicas, los mecanismos y significancia de esta interacción aún no se conocen con exactitud. Es así que, mediante técnicas de biología molecular, microscopia, ensayos comportamentales y farmacológicos, nos propusimos estudiar el rol de estas aminas biogénicas en la conducta de alimentación en C. elegans. Mediante ensayos de comportamiento, observamos que mutantes nulos tdc-1, deficientes de la síntesis de TA, aun estando bien alimentados, son hipersensibles a la disminución de la locomoción en el encuentro con el alimento (lo cual se asemeja al comportamiento de animales hambreados). Esto sugiere que la 5-HT y TA ejercen efectos antagónicos en este comportamiento. Mediante ensayos de imágenes de calcio in vivo, observamos que la actividad del par de neuronas tiraminérgicas (llamadas RIM) disminuye en ausencia de alimento y aumenta paulatinamente en el regreso al mismo. Además, el agregado exógeno de TA durante el ayuno rescata parcialmente la gran desaceleración de la locomoción en la realimentación. Estos resultados en conjunto, nos permiten hipotetizar que la inhibición de la actividad de la neurona tiraminérgica durante el ayuno favorece la exacerbación de los efectos dependientes de la señal serotoninérgica en la realimentación. Finalmente, intentamos caracterizar los mecanismos moleculares involucrados en esta intermodulación. Al evaluar la actividad de las neuronas serotoninérgicas NSM y ADF en animales deficientes de TA, determinamos que la falta de TA exacerba la señal serotoninérgica en la vuelta al alimento. Esto sugiere que la TA inhibe la actividad de las neuronas serotoninérgicas apoyando nuestra hipótesis de que la disminución de la actividad tiraminérgica en el ayuno es necesaria para la exacerbada liberación de 5-HT en la realimentación. Además, de los cuatro receptores tiraminérgicos conocidos (tres GPCRs TYRA-2, TYRA-3 y SER-2 y un canal de cloruro LGC-55), encontramos que tres de ellos están implicados en la modulación de la locomoción a través de un circuito paralelo río abajo de las neuronas serotoninérgicas: los receptores TYRA-2 y TYRA-3 estimulan la locomoción, mientras que SER-2 la disminuye. En resumen, nuestros resultados sugieren que la inhibición de las neuronas tiraminérgicas durante el ayuno es clave para el comportamiento de los animales en la realimentación. Considerando las similitudes que existen en las conductas de alimentación y a la conservación de los componentes neuronales implicados en su regulación en el reino animal, nuestros resultados podrían colaborar al entendimiento del rol de estas señales no sólo en invertebrados sino también en otros animales. Hemos mencionado además que C. elegans es un excelente modelo para realizar ensayos farmacológicos. Aprovechando esta ventaja y la cercanía evolutiva entre C. elegans y otras especies de nematodos parásitos, realizamos una búsqueda de compuestos con potencial actividad antihelmíntica. Las infecciones producidas por nematodos parásitos generan una sustancial morbilidad en billones de personas y pérdidas considerables del ganado y agricultura. Dado a las deficientes políticas de salud pública y a las malas condiciones de calidad de vida e higiene, estas infecciones afectan principalmente a los países más empobrecidos. A su vez, la aparición de parásitos resistentes en el ganado se ha convertido en una preocupación global y es una complicación emergente en las helmintiasis humanas. A pesar de esto, la industria farmacéutica ha relegado el desarrollo de nuevos antihelmínticos en las últimas décadas. Por lo expuesto, la investigación de moléculas con nuevos mecanismos de acción antihelmínticos es una necesidad urgente. La dificultad para realizar ensayos con parásitos en el laboratorio, la cercanía filogenética con las demás especies dentro del filo nematoda y su fácil manipulación genética convierten al nematodo de vida libre C. elegans en un modelo eficiente para el estudio de moléculas con potencial antihelmíntico. En el segundo capítulo de esta tesis realizamos un cribado de moléculas derivadas del imidazol en C. elegans con el objetivo de identificar nuevos compuestos con acción terapéutica, específicamente con potencialidad antihelmíntica. Encontramos un compuesto, el Diisopropil-fenil imidazol (DII), que produce letalidad selectiva en nematodos adultos, siendo inocuo para células humanas en cultivo HEK-293 y larvas de D. melanogaster. Al presentar un efecto nematicida específico, decidimos estudiar en mayor profundidad su modo de acción. Evaluando la resistencia a la droga de cepas mutadas en genes que codifican para blancos moleculares de antihelmínticos conocidos, encontramos que el DII actúa a través de la subunidad no- UNC-29 de un receptor ionotrópico colinérgico muscular (AChR). UNC-29, junto con las subunidades UNC-38, UNC-63, LEV-1 y LEV-8, ha sido tradicionalmente considerada como parte del AChR de tipo L sensible a la droga antihelmíntica Levamisol (L-AChR). Las drogas, como el levamisol, que actúan como agonistas de receptores ionotrópicos colinérgicos generan la despolarización rápida de la célula muscular y parálisis del gusano. Observamos que el DII no genera estos efectos tradicionales de los agonistas nicotínicos y tampoco desplaza la curva dosis-respuesta del levamisol, como lo haría un antagonista del L-AChR. Además, determinamos que los mutantes deficientes de las demás subunidades que conforman el L-AChR clásico, son sensibles al DII. Estos resultados en conjunto sugieren que el DII actúa a través de un AChR muscular, que contiene la subunidad UNC-29, distinto al L-AChR clásico. Existen suficientes evidencias que avalan la presencia de múltiples clases de AChRs musculares con composiciones de subunidades diferentes distribuidas en el cuerpo del animal. Esto apoya nuestra hipótesis de que el blanco molecular del DII en gusanos adultos podría ser un AChR aún no identificado. En general, las larvas de parásitos son más resistentes a los antihelmínticos clásicos como el levamisol. Sin embargo, determinamos que el DII es letal para las larvas y que existe otro blanco molecular distinto a UNC-29 implicado en este mecanismo. Esto presenta una ventaja terapéutica, ya que antihelmínticos que actúan a través de más de un mecanismo de acción otorgan una terapia más efectiva y retrasan la expansión de resistencias. Creemos que el DII constituye el puntapié inicial para el desarrollo de un compuesto con potencialidad terapéutica. El hecho de que el DII presente actividad nematicida específica y que actúe a través de un blanco molecular diferente al de los antihelmínticos clásicos, sienta las bases para la dilucidación completa de su mecanismo de acción, así como la evaluación de su efectividad en nematodos parásitos. En conclusión, en este trabajo de tesis explotamos la potencialidad del nematodo C. elegans con dos objetivos bien diferentes: 1) en el capítulo I nos centramos en intentar de contribuir con el entendimiento de un interrogante biológico fundamental: ¿cómo los circuitos neuronales producen comportamientos específicos que responden a las necesidades metabólicas del organismo?, y 2) en el capítulo II, con un perfil más aplicado, nos propusimos identificar nuevas moléculas con potencialidad antihelmíntica, que en el futuro puedan ser consideradas posibles terapias antiparasitarias.

Caenorhabditis elegans is a free-living nematode that has been used for approximately 60 years to answer to general biological questions. Its easy genetic manipulation, the knowledge of its entire connectome and the simplicity to study its behavior, make it an excellent model for addressing fundamental neurobiological questions and carry out pharmacological assays. In this Ph. D. thesis, we used the nematode C. elegans as a model to study the neural modulation of feeding behaviors and to search for compounds with therapeutic potential. An adequate feeding is essential for animal survival. The nervous system modulates motor activity depending on the availability of food in the environment and the nutritional internal state. When animals have experienced a long fasting period and find food again, they stay in a small area to fully exploit the new source of nutrients. The food stimulus both in mice and invertebrates produces serotonin (5-HT) release. In C. elegans, 5-HT modulates behaviors primarily related to the presence of food: it enhances pharyngeal pumping and egg-laying and suppresses locomotion. When C. elegans has been in absence of food for a long period of time and returns to food, the worm exhibits a drastic decrease in speed and stimulates pharyngeal pumping to promote food intake. It is known that the abrupt decrease in locomotion upon food encounter depends on 5-HT release from two serotoninergic neurons called NSM and ADF. On the other hand, tyramine (TA) and octopamine (OA), norepinephrine and epinephrine analogs in invertebrates, respectively, have the potential of exerting opposite effects to 5-HT, reducing pharyngeal pumping and egg-laying. Moreover, just as 5-HT modulates behaviors that promote feeding in the presence of food, OA, on the contrary, regulates behaviors that are important during starvation, like increasing locomotion to ease the foraging for food. Nevertheless, TA feeding-and-locomotion-related behaviors are still not entirely clear. Even though there is evidence of the serotoninergic and tyra/octopaminergic antagonistic effects, the mechanisms and relevance of this interaction are not yet known exactly. Thus, using molecular biology technics, microscopy, behavioral and pharmacological assays, we decided to study the role of these biogenic amines in food-related behaviors in C. elegans. Performing behavioral assays, we observed that tdc-1 null mutants, deficient in TA synthesis, even though well-fed, are hypersensitive to the decrease in locomotion upon food encounter (which resembles the behavior of starved animals). This suggests that 5-HT and TA exert antagonistic effects on this behavior. By calcium imaging in vivo assays, we observed that the activity of the pair of tyraminergic neurons (called RIM) decreases in absence of food and increases gradually when animals return to food. Furthermore, the addition of exogenous TA during starvation partially rescues the enhanced slowdown of locomotion in refeeding. Taken together, these results allow us to hypothesize that the inhibition of the tyraminergic neuron activity during starvation favors the exacerbation of serotonergic signal-dependent effects on refeeding. Finally, we tried to characterize the molecular mechanisms involved in this intermodulation. When evaluating the activity of the serotoninergic neurons NSM and ADF in TA-deficient animals, we determined that the lack of TA exacerbates the serotoninergic signal on the return to food. This suggests that TA inhibits the activity of serotoninergic neurons supporting our hypothesis that the reduction in tyraminergic activity during starvation is necessary for the exacerbated release of 5-HT upon refeeding. In addition, of the four known tyramine receptors (three GPCRs TYRA-2, TYRA-3 and SER-2 and a chloride channel LGC-55), we found that three of them are involved in the modulation of locomotion through a parallel circuit downstream of serotonergic neurons, namely TYRA-2 and TYRA-3 receptors stimulate locomotion, while SER-2 decreases it. Summing up, our results suggest that the inhibition of tyraminergic neurons during starvation is key for animals’ behavior upon refeeding. Taking into account the similarities in feeding behaviors and the conservation of neuronal components involved in their regulation in the animal kingdom, our results could contribute to the understanding of the role of these signals not only in invertebrates but also in other animals. We have also claimed that C. elegans is an excellent model to carry out pharmacological assays. Thus, taking advantage of this and the evolutionary closeness between C. elegans and other parasitic nematode species, we conducted a search for compounds with potential anthelmintic activity. Parasitic nematode infections generate substantial morbidity in billions of people and considerable losses to livestock and agriculture. Due to deficient public health policies and low quality of life and hygiene conditions, these infections mainly affect the poorest countries. Moreover, the appearance of resistant parasites in livestock has become a global concern and is an emerging complication in human helminth infections. In spite of this, the pharmaceutical industry has relegated the development of new anthelmintics in the last decades. Therefore, the investigation of molecules with new anthelmintic mechanisms of action is an urgent need. The difficulty in testing parasites in the laboratory, the phylogenetic relationship with other species within the phylum Nematoda and the ease of its genetic manipulation, make the free-living nematode C. elegans an efficient model for the study of molecules with anthelmintic potential. In the second chapter of this Ph. D. thesis, we screened imidazole-derived molecules in C. elegans with the aim to identify new compounds with therapeutic action, specifically with anthelmintic potential. We found one compound, Diisopropylphenyl-imidazole (DII), that produces selective lethality in adult nematodes, being innocuous for cultured human HEK-293 cells and D. melanogaster larvae. As this compound has a specific nematicidal effect, we decided to study its mode of action in greater depth. By the assessment of drug resistance of strains mutated in genes encoding known anthelmintic molecular targets, we found that DII acts through a non- UNC-29 subunit of a muscle cholinergic ionotropic receptor (AChR). UNC-29, along with the UNC-38, UNC-63, LEV-1 and LEV-8 subunits, has traditionally been considered as part of the L-type AChR, sensitive to the anthelmintic drug Levamisole. Drugs, such as levamisole, which act as ionotropic cholinergic receptor agonists, generate rapid depolarization of the muscle cell and worm paralysis. We observed that DII does not generate these well-known effects of nicotinic agonists and does not shift the dose-response levamisole curve either, as a L-AChR antagonist would do. Furthermore, we determined that mutants deficient in the other subunits that form the classic L-AChR are sensitive to DII. Altogether, these results suggest that DII acts through a muscle AChR, which contains the UNC-29 subunit, different from the classic L-AChR. There is sufficient evidence to support the presence of multiple classes of muscle AChRs with different subunit compositions distributed throughout the body of the animal. This supports our hypothesis that de DII molecular target could be a still unidentified AChR. In general, parasite larvae are more resistant to classic anthelmintics like levamisole. Nonetheless, we determined that DII is lethal to larvae and that there is another molecular target other than UNC-29 involved in this mechanism. This has a therapeutic advantage since anthelmintics that act through more than one mode of action provide a more effective therapy and delay the expansion of resistance. We believe that DII constitutes the starting point for the development of a compound with therapeutic potential. The fact that DII has specific nematicidal activity and that acts through a different classic anthelmintic molecular target lays the groundwork for the complete elucidation of its mechanism of action, as well as the evaluation of its effectiveness in parasitic nematodes. In conclusion, in this thesis work we exploited the potentiality of the nematode C. elegans with two very different objectives: 1) in chapter I, we focused on trying to contribute to the understanding of a fundamental biological question, namely how neural circuits produce specific behaviors that respond to the organism metabolic needs?, and 2) in chapter II, with a more applied view, we proposed to identify new molecules with anthelmintic potential that could in the future be considered as possible antiparasitic therapies.