Estrés genómico y expresión de la apomixis en pasto llorón (Eragrostis curvula (Schrad.) Nees.)

Abstract

El estrés ejerce sus efectos sobre el organismo, no sólo a través de las vías de respuesta fisiológica, sino también a través de vías genéticas y epigenéticas. Muchos autores sostienen que el estrés es un factor clave para explicar el papel evolutivo del sexo en los organismos de modo reproductivo facultativo. Por lo tanto, es esperable que los mismos se crucen más frecuentemente bajo situaciones de estrés, facilitando la adaptación a ambientes cambiantes. Eragrostis curvula es un complejo polimórfico donde la mayoría de sus miembros se reproducen por apomixis, reproducción asexual a través de semillas, que conduce a la generación de progenies genéticamente idénticas a la planta madre. El objetivo de esta tesis fue determinar el efecto de diferentes factores que generan estreses genómicos sobre la expresión de la apomixis en pasto llorón, como el estrés hídrico, el cultivo in vitro, la poliploidización y la hibridación intraespecífica. Para ello, se analizaron sacos embrionarios de plantas de distintos genotipos de pasto llorón luego de haber sido sometidas a dichas condiciones. Además, se realizaron pruebas de progenie con marcadores moleculares y se analizó el nivel de metilación de los genomas luego de los diferentes tratamientos. Antes de evaluar el efecto de situaciones estresantes sobre el modo reproductivo fue necesario analizar la estabilidad del carácter a lo largo del periodo de floración, hallándose que el cv. Tanganyika INTA presenta una sexualidad promedio menor al 2 % en condiciones de invernáculo. Plantas del cv. Tanganyika INTA bajo condiciones de estrés por déficit hídrico mostraron un 14 % de sacos sexuales, indicando un incremento de expresión de la sexualidad respecto de las plantas control. Luego de un periodo de rehidratación mostraron una sexualidad residual del 5,3 %, indicando una disminución significativa de la misma, siendo, sin embargo, significativamente diferente del control. Se realizaron pruebas de progenie con marcadores RAPDs y se detectaron polimorfismos solamente en las plantas sometidas a estrés hídrico, aunque en una proporción menor a la esperada de acuerdo a los análisis citoembriológicos, indicando que no todos los sacos embrionarios sexuales producidos dan lugar a plantas viables. El cv. Tanganyika USDA no evidenció en ningún momento la capacidad de generar sacos sexuales, clasificándoselo como apomíctico obligado. El genotipo facultativo UNST1131 presentó una proporción de procesos sexuales del 18,5 % bajo condiciones de estrés hídrico. Sin embargo este valor no fue significativamente distinto al control (10 %), debido principalmente a la gran variabilidad observada. Para evaluar efectos mediados por ABA se realizaron ensayos de aplicación foliar en plantas del cv. Tanganyika INTA normalmente regadas. El análisis citoembriológico no permitió detectar diferencias significativas en el número de sacos sexuales en relación con el control, descartándose momentáneamente a la concentración de esta hormona como mediadora del efecto generado por estrés. También se analizó el efecto del cultivo in vitro realizando diferentes ensayos en los que se varió el tipo de explanto, el medio de cultivo y la duración de los mismos. Se evaluaron los cultivares Tanganyika USDA y Tanganyika INTA. Solo uno de los ensayos (exposición a medios selectivos) generó un efecto significativo sobre el número de sacos sexuales producidos, que incrementaron, demostrando una cierta plasticidad del carácter en situaciones de estrés. Estos resultados indicarían que situaciones de estrés previas y durante la etapa de floración podrían estar regulando la expresión de la sexualidad en genotipos apomícticos facultativos de pasto llorón. Es evidente que en los cvs. Tanganyika USDA, Tanganyika INTA y UNS1131 expresan diferentes niveles de apomixis/sexualidad, desde cero a 33%. Por otro lado, este estudio permitió demostrar que no solo las condiciones externas promueven estreses genómicos que alteran la expresión de la apomixis en pasto llorón. Condiciones como la poliploidización y la hibridación intraespecífica también afectan al modo reproductivo. El análisis de la expresión de la apomixis a través del tiempo en dos híbridos (105 y 60) obtenidos a partir de la cruza entre materiales contrastantes para el modo reproductivo mostró diferencias en la expresión del carácter. El primero (105) mostró un comportamiento errático en las proporciones de procesos apomíctico/sexuales, con estabilización del carácter tendiente a una relación 1:1 mientras que el otro, (60) presentó solo sacos sexuales en las dos primeras floraciones y una pequeña proporción de sacos apomícticos en la tercera. Los resultados obtenidos en las pruebas de progenie mostraron correlación con los observados por estudios citoembriológicos. Dada la relación entre la apomixis y el ambiente, podría especularse que los genes involucrados en el modo reproductivo son controlados por factores epigenéticos como la metilación del ADN. Se realizaron análisis comparativos sobre los genomas (AFLP) y epigenomas (MSAP) de varios grupos de plantas con el fin de establecer el efecto de estreses genómicos sobre el genoma y epigenoma. Los grupos de plantas comparadas fueron: 1) tratadas por estrés hídrico y plantas control del cv. Tanganyika INTA y 2) plantas híbridas del primer año de análisis y luego de tres años. En el primer caso, no se hallaron cambios genéticos en el tiempo en las plantas sometidas a estrés hídrico y control, mientras que las comparaciones con marcadores MSAP permitieron evidenciar un gran número de marcadores polimórficos debidos a procesos de metilación y desmetilación del ADN entre los dos tiempos de muestreo. Si bien no existe una diferencia estadística entre la suma de cambios ocurridos en el tiempo entre el grupo de plantas control y tratadas, se observó un alto grado de correlación (R2= 0,7949) entre los porcentajes de cambios ocurridos en el tiempo y los porcentajes de sexualidad calculados a través del análisis citoembriológico para cada individuo. En el híbrido 60 no se hallaron cambios genéticos en el tiempo, pero si se hallaron en el híbrido 105. En el análisis de los perfiles epigenéticos, el híbrido 60 mostró una mayor proporción de procesos de metilación, mientras que el 105 reveló una tendencia mayoritaria hacia la desmetilación del ADN. Esto podría atribuirse a una mayor inestabilidad genómica, que podría asociarse a un comportamiento más errático del modo reproductivo. La secuenciación de una muestra de los polimorfismos obtenidos por AFLP y MSAP mostró una alta proporción (55 %) de secuencias sin homología con regiones conocidas del genoma, pudiendo tratarse de metilaciones y desmetilaciones en regiones no codificantes o en secuencias del genoma aún no informadas. Las secuencias que mostraron homología con secuencias previamente anotadas fueron principalmente elementos transponibles. Los resultados aquí presentados y los previos obtenidos por el grupo de trabajo nos permiten hipotetizar que existe una región determinante de la apomixis, que estaría ausente en las plantas tetraploides sexuales. La misma podría contener regiones repetitivas y con redundancia génica que estarían silenciando la sexualidad en plantas apomícticas. Existen numerosas evidencias sobre el control mediado por pequeños ARNs en el silenciamiento de regiones repetitivas y elementos transponibles. Ante determinadas circunstancias, como condiciones de estrés prolongado, en esta región podría estar ocurriendo un efecto de des-represión epigenética, permitiendo un aumento en la proporción de procesos sexuales. Si bien aún resta trabajo experimental para comprobar esta hipótesis, los procesos de metilación y desmetilación observados y los elementos transponibles secuenciados serían evidencias preliminares a considerar.

Stress affects the organisms generating physiological, genetic and epigenetic responses. Many authors argue that stress is a key factor to explain the evolutionary role of sex in organisms with facultative reproductive mode. Therefore, it is expected that facultative organisms will cross more frequently under stress, facilitating the adaptation to changing environments. Eragrostis curvula constitutes a polymorphic complex where most of its members reproduce by apomixis, asexual reproduction through seeds, which leads to the generation of progenies genetically identical to the mother plant. The aim of this work was to study the effect of different factors that generate genomic stress on the expression of apomixis in weeping lovegrass, such as water stress, in vitro culture, polyploidization and intraspecific hybridization. For this purpose, embryo sacs of different weeping lovegrass genotypes were observed after being the plants subjected to these stress conditions. Moreover, progeny tests were conducted by using molecular markers and the genome methylation status after different treatments was also assessed. Before evaluating the effect of the mentioned stressors on the reproductive mode it was necessary to analyze the stability of the trait throughout the flowering period, finding that plants of the cv. Tanganyika INTA growing in the greenhouse exhibited an average of sexuality less than 2 %. Plants of this cultivar subjected to water stress showed an average of 14% of sexual embryo sacs, indicating an increased expression of sexuality compared to control plants. After a rehydration period these plants showed an average of sexuality of 5.3 %, indicating a significant reduction in the number of sexual embryo sacs, being, however, significantly different from control plants. Progeny tests were performed with RAPDs markers detecting polymorphisms only in plants subjected to water stress, although in a less ratio than the expected according to the cyto-embryological analysis, indicating that not all the sexual embryo sacs produced develop into viable plants. Plants of the cv. Tanganyika USDA did not show at any time the ability to generate sexual embryo sacs and being classified as full apomictic one. The facultative genotype UNST1131 showed an expression of sexual processes of 18.5 % under water stress conditions, however this value was not significantly different to the control (10%), mainly due to the large variability exhibited by this material. To assess effects mediated by ABA, foliar application were performed on normally watered cv. Tanganyika INTA plants. The cyto-embryologic analysis was unable to detect significant differences in the number of sexual embryo sacs compared to the control, dismissing for the moment the hormone concentration as a mediator of the effect generated by stress. The effect of in vitro culture was also analyzed performing different tests in which the explant type, culture media and time under culture were changed. Tanganyika USDA and Tanganyika INTA cultivars were evaluated. In only one of the trials (exposure to selective media) a significant effect on the number of sexual embryo sacs was observed, which increased, showing a certain plasticity of the trait when the plants were growing under stress conditions. These results indicate that stress situations before and during the flowering stage might be regulating the expression of sexuality in facultative apomictic genotypes of weeping lovegrass. It is evident that Tanganyika USDA, Tanganyika INTA and UNS1131 cultivars express different levels of apomixis/sexuality ratios, from zero to 33%. This study also demonstrated that not only external conditions promote genomic stresses that alter the expression of apomixis in weeping lovegrass. Conditions such as intraspecific hybridization and polyploidization also affect the reproductive mode. The analysis of the expression of apomixis over time in two hybrids (#105 and #60) obtained from crosses between sexual X apomictic materials showed differences in the expression of the trait. The first one (#105) showed an erratic behavior in the ratio of apomictic/sexual processes, ending after two years with a ratio of 1/1, while the other (#60), only showed sexual embryo sacs on the two first blooms and a small proportion of apomictic embryo sacs during the third one. The results of progeny tests correlated very well with the cytoembryological observations. Given the close relationship between apomixis and environment, it might be speculated that the genes involved in the control of the reproductive mode could be subjected to epigenetic regulation, involving DNA methylation in some way. Comparative analyses at genomic (AFLP) and epigenetic (MSAP) levels were performed on different groups of plants in order to analyze the effect of genomic stresses. The groups compared were: 1) plants under water stress and normally watered plants (control) belonging to cv. Tanganyika INTA; 2) recently hybridized plants (first blooming) and the same plants in the third blooming period. In the first case (water stressed vs. control plants), no genetic changes over time were observed while comparisons with MSAP showed a large number of polymorphic markers due to processes of DNA methylations and de-methylations, showing a high correlation level (R2 = 0.7949) between the percentages of changes over time and the number of sexual embryo sacs. In the hybrid #60 no genetic changes were detected as it was in the #105. However, the analysis of epigenetics profiles showed a higher proportion of methylation processes in the hybrid #60 than in #105, while DNA demethylation levels were in the opposite direction. This could be associated with a higher genomic instability in #105 than in #60 that could be correlated with an increased erratic behavior of the reproductive mode. The sequencing of a sample of the polymorphic AFLP and MSAP bands showed a high proportion (55 %) of sequences without homology to previously annotated sequences, being probably noncoding regions or unknown genes. The other sequences were mainly transposable elements. The results presented here and those previously reported by our group allow us to hypothesize that there is a critical region conditioning apomixis, which would be absent in sexual tetraploid plants. This region could contain repetitive elements and gene redundancy that might be silencing sexuality in apomictic plants. Under certain circumstances, such as long stress periods, the control could be relaxed, allowing an increase in the proportion of sexual processes.