Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem: http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/511
Título : Estudio de la interacción de los diacilgliceroles y los dominios lipídicos con el receptor de acetilcolina nicotínico
Autor(es) : Kamerbeek, Constanza Belén
Director(es) : Barrantes, Francisco J.
Co-director(es) : Borroni, María Virginia
Palabras clave : Bioquímica; Proteínas; Sistema nervioso; Diacilglicerol; Receptores nicotínicos
Resumen : El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es un canal iónico activado por ligandos, presente en el sistema nervioso central y en la unión neuromuscular. Su estabilidad en la membrana celular es de suma importancia, ya que determina el nivel de respuesta colinérgica, que puede ser alterada ante diversas situaciones fisiológicas y patológicas. En esta Tesis utilizamos como modelo experimental a las células CHO-K1/A5, una línea celular que expresa de forma estable al AChR muscular adulto. En el primer capítulo nos centramos en el estudio de la posible acción de los diacilgliceroles (DAG) sobre la expresión/distribución del AChR. Realizamos los experimentos con el dioctanoilglicerol (DOG), y definimos dos tiempos de tratamiento, a los que denominamos tiempos cortos (3-4 hs) y largos (18 hs) de incubación. A tiempos cortos, el DOG aumenta los niveles de AChR presentes en la superficie celular, mientras que a tiempos largos los disminuye con el concomitante aumento de los AChR intracelulares. A su vez, el incremento de los DAG endógenos como consecuencia de la alteración de diversas vías metabólicas, afecta de igual manera al AChR a tiempos cortos. Como el tratamiento con un éster de forbol, molécula análoga al DAG por su capacidad de interaccionar con los dominios C1 de diversas proteínas, resultó en los mismos cambios sobre la distribución del AChR, concluimos que los efectos del DOG eran debidos a su papel como segundo mensajero lipídico. Mediante el empleo de inhibidores enzimáticos y de anticuerpos específicos para las proteínas quinasas C (PKC) clásicas, las PKC noveles y las PKD, determinamos que los DAG a tiempos cortos de incubación favorecerían la inhibición de las PKCc al favorecer su desfosforilación, y esto disminuiría la internalización del AChR. Por otra parte, el estímulo con DOG a tiempos largos de las distintas PKC estudiadas, provocaría el efecto opuesto. El segundo capítulo se centró en el estudio de la distribución de los clústeres de AChR, generados por la unión de anticuerpos, en dominios lipídicos con diferentes valores de polarización generalizada (GP). Esta medición se realizó gracias a la tinción de las células con di-4-ANEPPDHQ, una sonda fluorescente capaz de poner en evidencia los cambios en la polaridad de la membrana, relacionados a un orden de membrana determinado. La depleción del colesterol (Col) disminuye los valores promedio de la GP de la membrana, aumentando en consecuencia la asociación de los clústeres de AChR a dominios de membrana más desordenados. Por otra parte, la despolimerización del citoesqueleto de actina con Latrunculina A, produce el efecto contrario al aumentar la asociación de los acúmulos de AChR con dominios de membrana más ordenados. Estos resultados indican que la distribución del AChR en la superficie celular depende del contenido de Col y de la integridad del citoesqueleto de actina. Por otra parte, el AChR se internaliza en pequeñas vesículas con valores bajos de la GP y bajo contenido de Col, situación que se mantiene frente a la depleción del Col producida por el tratamiento con metil-β-ciclodextrina, demostrando entonces que la endocitosis del AChR requiere de la disociación previa del receptor con dominios ricos en Col presentes en la membrana.
The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is a ligand-gated ion channel, present at the neuromuscular junction and central nervous synapses. Its stability at the cell membrane is important in determining cholinergic responses and can be altered under physiological and pathological conditions. In this thesis, we used CHO-K1/A5 cells, a cell line that expresses the adult muscle AChR in a stable manner. In the first chapter, we focus on the study of the possible effects of diacylglycerols (DAGs) on expression/distribution of AChR. We performed experiments with dioctanoylglycerol (DOG), and define two treatment times, which we name short (3-4 h) and long (18 h) incubation times. DOG increases AChR levels on the cell surface at short incubation times. At long treatment times however, surface AChRs decrease with the concomitant increase of intracellular AChRs. Besides, endogenous DAGs increase due to the alteration of various metabolic pathways, equally affecting AChR at short times. Since treatment with a phorbol ester, a DAG analogous because of its ability to interact with the C1 domain of different proteins, resulted in similar changes on AChR distribution, we conclude that DOG effects were due to its role as a lipid second messenger. By using specific enzyme inhibitors and antibodies to classical and novel protein kinases C (PKC) and PKD, we determined that DAGs inhibit PKCc by promoting its dephosphorylation at shorter incubation times, and thus the internalization of AChR decreases. Moreover, DOG stimulation of different PKCs at long treatment times, causes the opposite effect. The second chapter is focused on the study of AChR clusters distribution, generated by antibody binding, at lipid domains with different generalized polarization (GP) values. This measurement was performed by staining cells with di-4-ANEPPDHQ, a fluorescent probe that senses changes in the polarity of the membrane, related to membrane order. Cholesterol depletion diminishes the mean cell membrane di-4- ANEPPDHQ GP and concomitantly the number of AChR clusters associated with more disordered membrane domains increases. Depolymerization of the filamentous actin cytoskeleton by Latrunculin A has the opposite effect, with more AChR clusters associated with more ordered domains. In conclusion, the distribution of AChR submicron-sized clusters at the cell membrane depends on cholesterol content and cytoskeleton integrity. AChR internalizes via small vesicles having lower GP and lower cholesterol content than cell surface. This also occurs upon cholesterol depletion by methyl-β-cyclodextrin. Thus, AChR endocytosis is primed by receptor dissociation from Chol-rich plasmalemma domains.
URI : http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/511
Aparece en las colecciones: Tesis de postgrado

Ficheros en este ítem:
Fichero Tamaño Formato  
TESIS CBK.pdf185,87 MBAdobe PDFVisualizar/Abrir


Los ítems de DSpace están protegidos por copyright, con todos los derechos reservados, a menos que se indique lo contrario.