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Título : Cultivo y propiedades medicinales de Grifola gargal y Grifola sordulenta
Autor(es) : Postemsky, Pablo D.
Director(es) : Curvetto, Néstor Raúl
Palabras clave : Botánica; Hongos; Bioeconomía; Cáscara de girasol; Antioxidantes; Hongos comestibles; Antimutagénico
Resumen : Los hongos son fuente de alimento y medicina desde tiempos remotos. Por su valor nutracéutico y como fuente de nutricéuticos se han utilizado para mantener y mejorar la salud, preservar la juventud y promover la longevidad. También son fuente de compuestos químicos bioactivos útiles para la preparación de productos farmacéuticos. De las 700 especies de hongos comestibles investigadas, sólo unos 50 hongos tienen valor medicinal y entre ellos Grifola frondosa es uno de los más notables e investigados, especialmente como estimulador del sistema inmune y por sus propiedades antitumorales en la lucha contra el cáncer. En los bosques andino patagónicos de Argentina y Chile existen dos representantes del género Grifola: G. gargal Singer y G. sordulenta (Mont.) Singer, para los cuales no se ha investigado suficientemente sobre su biología y por lo tanto no se ha desarrollado aún una tecnología apropiada para su cultivo, como tampoco se han hecho estudios sobre sus posibles propiedades medicinales y aplicaciones no solo terapéuticas sino también biotecnológicas. Por ello se investigó la factibilidad de cultivarlos en condiciones controladas y a su vez se profundizó en el conocimiento de distintos aspectos biológicos de interés. Por otra parte, la actividad medicinal hallada en políporos y en especial en Grifola frondosa apoya la formulación de la hipótesis que plantea también la presencia de actividad antioxidante y/o antigenotóxica en estas especies. La confirmación de tales propiedades es necesaria para sostener más investigación sobre su uso medicinal y resulta de importancia en la propuesta de posibles variedades de productos a partir de ellos, lo cual otorgaría un plus como valor agregado de estos hongos. Para comprender aún más las condiciones de crecimiento de estas especies se realizaron cuatro campañas recorriendo diferentes bosques de robles del Parque Nacional Lanín. Allí, con la ayuda de residentes del lugar y micólogos, se pudieron recolectar fructificaciones sólo en determinados lugares, así como también se tomaron datos de las colonias en crecimiento y muestras de G. gargal causando podredumbre. Asimismo, se aislaron dos cepas (cepa B y G9) de G. gargal, una proveniente de un árbol en pie y otra tomada de un roble caído que llevaba más de 20 años produciendo fructificaciones. La historia de los bosques de roble, informada por otros autores, revela que durante la última glaciación fueron fragmentados y en consecuencia se desarrollaron procesos de variabilidad genética entre los mismos. Algunas de estas variables son el contenido y calidad de ciertos compuestos polifenólicos los cuales se sabe que son importantes en la biología de los hongos degradadores de la madera. En consecuencia esto indicaría una variabilidad entre cepas de los diferentes bosques de robles para G. gargal. Dos cepas, correspondientes a G. gargal (cepa A) y G. sordulenta, fueron obtenidas del Centro de Investigación y Extensión Forestal Andino Patagónico (CIEFAP). Hallar las condiciones óptimas en la producción de micelio y cuerpos fructíferos es un paso fundamental para la producción optimizada de los compuestos con valor nutricional, y como fuente de nutricéuticos y fármacos hipotéticamente presentes en estos hongos. El análisis del crecimiento micelial de G. gargal y G. sordulenta en agar nutritivo reveló que para ambas especies, las mejores condiciones de cultivo fueron pH 4, 18ºC y medio de cultivo MYPA 16 suplementado con 0,4% de cáscara de girasol en polvo. Así, fue posible disminuir el tiempo para la obtención de inóculo de excelente calidad y el cultivo de las cepas en este medio fue posteriormente utilizado en forma rutinaria para su mantenimiento y para su uso como inóculo. Los resultados presentados fueron analizados por una posible pérdida de vigor (luego de tres años de subcultivos) y se halló que ambas cepas no perdieron vigor y que además hubo una mejora en la velocidad de colonización por G. sordulenta y ello se puede explicar por haber desarrollado una adaptación a los ingredientes del medio, concluyendo que las condiciones de rutina empleadas fueron adecuadas para conservar su vigor por más de 12 subcultivos. El aumento en contenido de polvo de cáscara de girasol no modificó la velocidad de colonización de la cepa A de G. gargal por lo que no se justifica su aumento en el medio de cultivo por encima del 0,4 % para esta especie; no se encontraron diferencias en la velocidad de colonización entre las cepa A, B y G9. Usualmente se observa en el stock de cepas de los laboratorios de micología que algunas cepas producen primordios y/o verdaderos cuerpos fructíferos un tiempo después que son almacenadas. Esto llevó a utilizar este método de cultivo in vitro en condiciones controladas para dilucidar los procesos que subyacen en la morfogénesis fúngica, i.e.: la diferenciación del micelio vegetativo a micelio reproductivo. Las observaciones realizadas con lupa y microscopio a G. frondosa, G. gargal y G. sordulenta, fueron comparadas con las observaciones realizadas por otros autores en la bibliografía hallándose algunas diferencias de importancia taxonómica en cuanto a velocidad de crecimiento, morfología de las colonias, cambios de coloración en el medio de cultivo y tipo de degradación de compuestos fenólicos, estudiada in vitro. El aspecto al microscopio de las hifas generativas, gloeopleuras, esqueletales, presencia de clamidosporas y estructuras cristaloides, también en comparación con las observaciones de otras investigaciones, indicó algunas diferencias que permiten conocer mejor la variabilidad entre cepas de estas especies. El estudio de las formaciones morfogénicas in vitro de G. gargal y G. sordulenta fue útil para detectar cambios producidos en estos cultivos luego de aplicar diferentes condiciones lumínicas. La irradiación con luz blanca durante el crecimiento vegetativo de G. gargal previno una demora significativa del crecimiento de micelio en cajas de Petri causadas por temperaturas desfavorables (c.a. 21ºC). Las diferentes condiciones de luz produjeron cambios en el metabolismo secundario y en la diferenciación morfogénica de los cultivos. La respuesta a estas condiciones lumínicas fue mayor en G. gargal que en G. sordulenta. Los resultados indicaron que ambas especies de Grifola fueron sensibles a la irradiación lumínica, con respuestas morfogénicas de distinto tipo e intensidad, si bien la luz blanca fue más efectiva. En ausencia del estímulo luminoso, ambas especies del género fueron capaces de mostrar eventos morfogénicos. En el caso de G. gargal, en presencia del estímulo luminoso, la cepa A fue más sensible que la B en la presentación de respuestas fotomorfogénicas. Estos resultados registrados para los distintos anchos de banda de irradiación lumínica son sugerentes de la participación de más de una molécula fotorreceptora. Para estimar la capacidad ligninolítica in vitro, se cultivó G. gargal y G. sordulenta en medios diferenciales conteniendo diferentes compuestos fenólicos. Para fines comparativos y para poder extrapolar los resultados al cultivo, resultó útil realizar este estudio en forma simultánea con otras dos especies poliporales que tienen una buena performance en fermentaciones en estado sólido empleando cáscara de girasol como sustrato: G. frondosa y Ganoderma lucidum (dos cepas). El estudio reveló la expresión de enzimas polifenol oxidasas en diferentes momentos del crecimiento y con diferentes patrones. Se sugiere que una de estas sería la enzima lignina peroxidasa (LiP). En otro estudio se verificó la actividad de lacasas. Asimismo, la presencia de la enzima con actividad de Mn-peroxidasa (MnP), fue también detectada, ya que en presencia de 20 ppm de Mn(II) en sustratos a base de cáscara de girasol la velocidad de crecimiento micelial fue mayor; asimismo en el caso de G. sordulenta causó un aumento en la densidad micelial aparente. En otro análisis similar se estudió el crecimiento de estas especies en medios diferenciales conteniendo diferentes fuentes de carbohidratos para determinar la actividad de la enzima celobiosa deshidrogenasa. El crecimiento fue en todos los casos moderado a bajo. Se determinó que G. gargal crece mejor en xilulosa y pectina, lo cual indicaría una preferencia por la fracción hemicelulósica de los sustratos. Grifola sordulenta por su parte, crece bien en celulosa y xilulosa y presentó actividad de la enzima celulosa deshidrogenasa. La velocidad de crecimiento y la densidad de la colonización en los medios de carbohidratos fue mayor en las colonias de G. frondosa y Ganoderma lucidum superando a G. gargal y G. sordulenta que si bien crecieron en todos los medios, mostraron menor habilidad para colonizarlos. Por lo cual ambos estudios en medios diferenciales mostraron una menor performance in vitro, lo cual permitió prever un desempeño regular a bajo al extrapolar estos resultados al cultivo en sustratos basados en cáscara de girasol. En algunas especies el cultivo de micelio en medios líquidos ofrece ciertas ventajas como reducción de las pérdidas por contaminación, utilización de espacios más reducidos, y fácil recolección de la biomasa y de los metabolitos disueltos en el medio. Se realizaron cultivos de G. gargal y G. sordulenta en medio líquido agitado empleando Erlenmeyers de 250 ml y 500 ml, y frascos de 3 l, así como también en medio líquido estacionario empleando fuentes de vidrio de 4 l. Se compararon los diferentes sistemas considerando el trabajo que requiere cada técnica y la cantidad de biomasa que produce. Para G. gargal se encontró favorable el cultivo en frascos de 3 l, y para G. sordulenta en Erlenmeyers de 250 ml, obteniéndose una biomasa de 4 y 18 g/l en 20 días de cultivo, respectivamente. En ambas especies la temperatura óptima para este cultivo fue de c.a. 18ºC. En este trabajo se determinó que la suplementación con diferentes reguladores del crecimiento vegetal y/o vitaminas o aminoácidos, o sólo con bencilaminopurina (0,1-10 mg/l) a los medios de ambas especies no incrementa significativamente la biomasa. Por otra parte, mediante el empleo de inóculo homogeneizado se consiguió disminuir la variabilidad dentro de los tratamientos en comparación con el uso de discos de micelio cultivado en agar como inóculo. Los diferentes protocolos suministraron material micelial con diferentes cualidades para ensayar posteriormente las propiedades antioxidantes de estas especies. El spawn en granos es el material que se emplea para inocular grandes masas de sustrato en el cultivo de hongos. La evaluación del crecimiento de micelio de G. gargal y G. sordulenta mediante el bioensayo de crecimiento lineal de Duncan (1997) reveló que ambas especies pueden ser cultivadas en granos de trigo, girasol, maíz y combinaciones de trigo con mijo y maíz con girasol; se determinó que el mejor crecimiento se logra para ambas especies con el cultivo en granos de trigo en el rango de pH de 5,3 a 6,4. La colonización completa de los granos de trigo, según la técnica de producción habitual en botellas de un litro, se produce más rápidamente a 24ºC, en comparación con el crecimiento del micelio en medios semisólidos y líquidos (c.a. 18ºC). En el cultivo en granos no se hallaron diferencias en el número de botellas que completaron la colonización a los días 25 y 30. Para ambas especies y para todos los tipos de granos, la mayor proporción de botellas colonizadas se observó a los 30 días. Considerando la cantidad de granos por gramo de spawn, el empleo de granos de trigo es el más indicado. Se empleó el test de crecimiento lineal de Duncan para evaluar la velocidad de colonización, la densidad aparente, el incremento del contenido de proteínas y de actividad de lacasas, y la degradación de fibras de G. gargal y de G. sordulenta en 20 formulaciones de sustrato a base de cáscara de girasol. Seguidamente se realizó otro ensayo para estudiar el efecto de ciertos suplementos en la velocidad de colonización y densidad aparente en 10 formulaciones más. Con la información recolectada se puede afirmar que ambas especies pueden crecer en estos sustratos, que la cáscara de girasol no necesita suplementos, como salvado o sustrato gastado de Pleurotus ostreatus, para sostener un buen crecimiento del micelio. Para G. gargal la colonización mejoró con un tratamiento ácido del sustrato, o con el agregado de cofactores enzimáticos (Mn(II) y Zn(II)), o de otras fuentes lignocelulósicas como roble, álamo o paja de trigo; para G. sordulenta se encontró que la colonización mejora sólo en cuanto a la densidad con un tratamiento ácido del sustrato, o con el agregado de cofactores enzimáticos (NH4(I), Mn(II) y Zn(II)). Con el establecimiento de un cultivo axénico de G. gargal y G. sordulenta sobre troncos sintéticos artificiales empleando cáscara de girasol como sustrato, se encontró que ambas especies pueden colonizar bien el sustrato, si bien con un ciclo productivo más extenso y mayor riesgo de contaminación a posteriori que para otras especies cultivadas con la misma técnica. La inducción con choque térmico a 5ºC produjo una sensible inducción de primordios, y se lograron algunas fructificaciones. El intercambio gaseoso es crucial para el desarrollo de los basidiomas, como era esperable según los antecedentes registrados en la literatura sobre la producción de G. frondosa. La secuencia de producción de ambas especies en las diferentes etapas es similar a la de G. frondosa: primordios granulares grises, que luego se diferencian en fructificaciones que se suceden en formas conocidas como cerebro, coliflor y racimo. Las propiedades antioxidantes de extractos metanólicos de cuerpos fructíferos, micelio de cultivo líquido y/o de cultivo de granos de trigo fueron analizadas en cuanto a sus propiedades de extinción de radicales (radical DPPH), y poder reductor, asimismo también se comparó el contenido de compuestos fenólicos y se caracterizaron los extractos metanólicos con la técnica de cromatografía de capa delgada. Los resultados hallados permitieron conocer las propiedades antioxidantes de G. gargal y G. sordulenta. Estas especies resultaron poseer muy buenos atributos antioxidantes, especialmente poder reductor. Las diferentes bioformas de micelio y también las formas de cultivo modifican cuali y cuantitativamente el contenido de antioxidantes causando variaciones en la actividad secuestrante de radicales y en el poder reductor. También se encontró que el micelio puede ser inducido a modificar su contenido en antioxidantes usando reguladores de crecimiento vegetal, y que la variación en el contenido de una propiedad antioxidante es independiente de la producida en otra propiedad antioxidante. La actividad antioxidante se debió en parte a la presencia de compuestos fenólicos pero no fueron los únicos compuestos activos. El análisis de cromatografía de capa delgada reveló además que la mayoría de los compuestos antioxidantes eran de naturaleza polar, en éstos siempre se hallaron las características de revelado correspondientes a compuestos fenólicos, y además en algunas bandas también se reveló la presencia de flavonoides. Por su parte los metabolitos apolares se observaron en todos los cromatogramas de los extractos. En algunos casos podría asociarse a compuestos fenólicos, mientras que en otros podría deberse a metabolitos no fenólicos. En G. sordulenta se halló que la actividad antioxidante estuvo parcialmente asociada a compuestos flavonoides. Las propiedades antigenotóxicas de cuerpos fructíferos y micelio de cultivo líquido de G. gargal; así como las harinas de granos de trigo fermentados con G. gargal, G. sordulenta y/o G. frondosa, fueron estudiadas con el test de mutación y recombinación somática en Drosophila melanogaster. El agente químico utilizando para causar las mutaciones (promutágeno) fue el DMBA (7-12-dimetilbenzo(α)antraceno). Con el estudio de la toxicidad de DMBA en distintos tratamientos pudo observarse un incremento en la mortalidad de las larvas de 9 a 45%, sin embargo cuando se agregaron los extractos fúngicos esta mortalidad disminuyó. La mutación y recombinación se evaluó como el número de spots blancos por cada cien ojos, mostrando un aumento en la frecuencia en aquellos tratamientos que contenían DMBA, y una disminución en los co-tratamientos conteniendo ambos: DMBA, y extractos fúngicos en el siguiente orden: fructificación de G. gargal, las tres harinas de granos colonizados y micelio de cultivo líquido de G. gargal. Se concluyó que el material evaluado resultó no tóxico per se y en combinación con el promutágeno y procancerígeno DMBA pudieron disminuir su mortalidad y la genotoxicidad. La respuesta protectora de los materiales fúngicos activó mecanismos de detoxificación en la larva de D. melanogaster que pueden ser desmutagénicos o bioantimutagénicos, y que fueron causados por ciertos compuestos bioactivos presentes en estos hongos superiores con actividad antigenotóxica como p.e. fenólicos, ácido linoleico, polisacáridos y polipéptidos. Luego de demostrar la ausencia de genotoxicidad, las propiedades antioxidantes y las propiedades antigenotóxicas de G. gargal y G. sordulenta, aun es necesario realizar estudios adicionales sobre la producción de cuerpos fructíferos por medio de la fermentación en estado sólido, y así facilitar su disponibilidad para su consumo como alimento. Hasta entonces una alternativa es la producción de micelio y metabolitos por medio del cultivo líquido. Finalmente, en un apartado final de la tesis se muestra información del contenido mineral y de diferentes nutrientes analizados en muestras de micelio, fructificaciones y granos de trigo colonizados, y como una novedad con potencial biotecnológico se sugiere la obtención de una harina de trigo colonizado por estos hongos para ser empleada como un alimento funcional.
As of ancient times, fungi have been and still are a source of food and medicine. Due to their nutraceutical value, they have been used to maintain and improve health, preserve youth and promote longevity. They are also a source of bioactive chemical compounds, which are, in turn, useful for the preparation of nutriceuttical and pharmaceutical products. Of the 700 edible mushroom species investigated to date, only 50 have medicinal value. Among these 50 is Grifola frondosa which is one of the most thoroughly investigated, particularly as a stimulator of the immune system and for its antitumoral properties. Grifola gargal Singer and G. sordulenta (Mont.) Singer, two representatives of the genus Grifola, in the andean patagonian forest in Argentina and Chile, have not been fully studied to date. Nor have their medicinal properties with their corresponding therapeutic applications been investigated. The purpose of this Ph. D. thesis was therefore to study the possibilities of cultivating G. frondosa under control conditions. On the other hand, the medicinal activity observed in polypores, particularly in G. frondosa, gives support to the hypothesis on the presence of antioxidant and /or antigenotoxic activity in these species. Confirming such properties is absolutely necessary to conduct further research in favor of its medicinal properties and to promote the proposal of possible varieties of products derived from them, which would, in turn increase the value of these fungi. To further learn about the growth conditions of these species four campaigns were done in the oak forests located within Lanín National Park. With the help of mycologists and people living in the area, fruiting bodies were collected. Growth data and samples of rotting G. gargal were also collected. Two new strains (strain B and G9) of G. gargal were isolated, one from a standing tree and another from a fallen oak which had been producing fruits for a period longer than 20 years. Previous research on the history of oak forests reveals that during the last ice age they were fragmented, thus inducing the development of processes of genetic variability. Some of these sources of variability variables are the content and quality of certain polyphenolic compounds which are known to be important in the biology of fungal decomposers of wood. This could therefore be indicative of variability among different strains of oak woodlands to G. gargal. Two strains, corresponding to G. gargal (strain A) and G. sordulenta, were obtained from the Centro de Investigación y Extensión Forestal Andino Patagónico (CIEFAP). Reaching to the optimal conditions for the production of mycelium and fruiting bodies is key to the optimized production of compounds with nutritional, nutraceutical and also as a source for nutriceuticals and pharmaceuticals hypothetically present in these fungi. Analysis of mycelial growth of G. gargal and G. sordulenta on nutrient agar medium revealed that for both species, the best culture conditions were pH 4, 18 ° C and culture medium supplemented with 0.4% MYPA of sunflower husk powder. It thus took shorter time to obtain high quality seed and cultivation of strains in this medium was subsequently used routinely both for its maintenance and use as inoculum. Results were analyzed by a possible loss of vigour (after three years of subcultures) and showed that both strains did not lose vigour and that there was a higher rate of colonization in Grifola sordulenta which could be due to the fact that they adapted to the ingredients of the medium, thus indicating that the routine mycelium growing conditions followed were adequate to maintain its force for more than 12 subcultures. On the other hand, the increase in the content of sunflower husk powder (0.4 %) did not alter the rate of colonization of strain A to G. gargal. This indicated that there is no need in increasing the amount of this supplement in this species. It was also observed that there were no differences in the rate of colonization between strain A, B, and G9. It has been observed that in stock strains of mycology laboratories some strains produce primordia and/or real fruitbodies after they are stored. This led us to use the method of in vitro culture under controlled conditions to deep on the processes underlying fungal morphogenesis, i.e the differentiation of vegetative mycelium to reproductive mycelium in these species. Observations of G. frondosa, G. gargal and G. sordulenta under a magnifying glass and microscope were compared with observations by other researchers. These comparisons revealed some differences in taxonomic significance in terms of growth speed, colony morphology, colour changes in the culture medium and type of degradation studied in vitro. The comparison of the microscopic appearance of generative hyphae, gloeopleuras, skeletal, presence of chlamydospores and crystalloid structures with observations from other researchers showed differences which will contribute to better understanding of the variability among strains of these species. The study of the in vitro morphogenic differentiation of G. gargal and G. sordulenta was useful as it helped detect changes in these crops after applying different light conditions. Irradiation with white light during the vegetative growth of G. gargal prevented a significant delay in growth of mycelium in Petri dishes, originated from unfavourble temperatures (c.a. 21 º C). The different light conditions produced, in fact, changes in secondary metabolism and morphogenic differentiation of cultured mycelia. Compared to findings from a study conducted in colonies grown in Petri dishes which had completed their vegetative growth in darkness and had received a thermal shock, in our study the effect of these environmental conditions was greater on G. gargal and similar on G. sordulenta. This indicates that both species of Grifola are sensitive to light irradiation with different morphogenic response type and intensity while white light is more effective. In the absence of light stimulus, both species of the genus were found to have the ability to show morphogenic events. In the case of G. gargal, strain A was observed to be more sensitive than B in the presentation of photomorphogenic responses. These results reported for different bandwidths of light irradiation are indicative of the involvement of more than one photoreceptor molecule. Grifola gargal and G. sordulenta were cultured in differential media containing different phenolic compounds in order to estimate ligninolytic ability in vitro. For comparative purposes and in order to extrapolate results to their cultivation, this study was carried out simultaneously with two other species of poliporales which exhibit a good performance behave naturally in solid state fermentation when using sunflower husks as main substrate. The study revealed polyphenol oxidase enzyme expression at different times and with different growth patterns. It is suggested that one of these could be the enzyme lignin peroxidase (LiP). It was further verified the activity of laccases. Mn-peroxidase (MnP) activity was presumably present because it was also detected in other strains of G. gargal and because addition of Mn (II) increased the rate of colonization with G. gargal cultivation on sunflower husk as substrate and aspect was better in G. sordulenta. Growth of these species in differential media containing different carbohydrate sources was also studied in order to determine the activity of the enzyme cellobiose dehydrogenase. In all cases, growth ranged from moderate to low. It was found that G. gargal grows best in xylulose and pectin, which could be indicaive of a preference for the hemicellulosic fraction of the substrates. In contrast, G. sordulenta was observed to grow well on cellulose and xylulose and evidenced cellulose dehydrogenase activity. Growth rate and density of colonization on media containing carbohydrates was higher in colonies of G. frondosa and Ganoderma lucidum, being even higher than those of G. gargal and G. sordulenta which, although they grew in all media, evidenced lower ability to colonize them. Both studies in differential media showed a lower in vitro performance, thus preannouncing a regular to low growth performance when these results were extrapolated to crop-based substrate sunflower husk. In some species the mycelium growing in liquid media have the advantage of reducing losses due to culture, the use of smaller spaces, and allow for an easy harvesting of the biomass and recovery of the metabolites dissolved in the medium. Cultures of G. gargal and G. sordulenta were carried out in agitated liquid medium using 250 and 500 ml Erlenmeyers flasks, and 3-liter bottles, as well as in liquid medium sources using 4-liter glass containers. Different systems were compared considering the work involved in each technique and the amount of biomass produced. Grifola gargal culture was carried out in 3-liter glass flasks and G. sordulenta was carried out in 250 ml Erlenmeyers flasks, yielding a biomass of 4 and 18 g/l after 20 days of culture, respectively. In both species, optimum temperature for this crop was c.a. 18 °C. In this work it was also determined that supplementation with different plant growth regulators and/or vitamins or aminoacids, or benzylaminopurine alone (0.1-10 mg/l) to the media of both species does not significantly increase biomass. Moreover, the use of homogenous innoculum reduced variability within treatments with respect to the use of disks of mycelium grown on agar as inoculum. The fungal material obtained from this work provided mycelial with different qualities to further test the antioxidant properties of these species. Grain spawn is the material used to inoculate large number of substrates in mushroom cultivation. The evaluation of mycelial growth of G. gargal and G. sordulenta by linear growth bioassay of Duncan (1997) revealed that both species can be cultivated in grains of wheat, sunflower, corn and wheat combinations with millet and corn with sunflower. It was also observed that optimum growth is achieved for both species when cultivation of wheat grains is in the pH range of 5.3 to 6.4. The full colonization of grains of wheat, following the production technique in traditional 1 liter bottles, occurs more rapidly at 24 °C, compared with the growth of mycelium in semisolid media and liquid (c.a. 18 ° C). In grain cultivation there were no differences in the number of bottles that completed the colonization by days 25 and 30. For both species and for all types of grains, the largest proportion of substrates in bottles was colonized after 30 days. Considering the number of grains per gram of spawn grains, using wheat is best recommended. Duncan linear growth test was used to assess the substrate mycelia colonization rate, bulk density, increased protein content and laccase activity, and fiber degradation produced G. gargal and G. sordulenta in 20 formulations based substrate sunflower husk. Another test was further conducted to study the effect of certain supplements on the colonization rate and apparent mycelial density in 10 formulations. Taken together, findings from our study support the conclusion that both species grow in these substrates, that sunflower seed husks needs no supplements such as bran or Pleurotus ostreatus spent substrate to sustain regular growth of the mycelium. For G. gargal colonization was found to improve with an acid treatment of the substrate or with the addition of enzyme cofactors (Mn (II) and Zn (II)), or other lignocellulosic sources such as oak, poplar, wheat straw. For G. sordulenta colonization was found to improve only in terms of mycelial density with an acid treatment of the substrate, or with the addition of enzyme cofactors (NH4 (I), Mn (II) and Zn (II)). The axenic culture of G. gargal and G. sordulenta on artificial synthetic logs using sunflower husks as substrate showed that both species can colonize the substrate, but with a longer production cycle and increased risk of contamination in relation to other mushroom species with the same technique. The thermal shock induction of 5 °C produced a significant induction of primordia and produced some fructifications. Gas exchange is crucial to the development of basidiomas, as expected based on previous research on the production of G. frondosa. The production sequence of both species at different stages is similar to that of G. frondosa: gray granular primordia that grow into fruitbodies of brain shape, then cauliflower shape and finally cluster flower. The antioxidant properties of methanolic extracts of fruiting bodies, mycelium from liquid culture and/or wheat grains were analyzed in terms of their radical scavenger properties (DPPH radical) and reducing power. The content of phenolic compounds was compared and methanol extracts were characterized using thin layer chromatography. It was thus possible to learn more about the properties of G. gargal and to confirm them for the first time in the case of G. sordulenta. These species have antioxidant reducing power properties. Different bioforms of mycelium and also different culture systems modify forms of qualitative and quantitative antioxidant content causing variations in radical scavenger activity and reducing power. In other words, the mycelium can be induced to change their antioxidant content using plant growth regulators and variability in the content of antioxidant property is independent of that produced in other antioxidant property. Antioxidant activity was found to be due in part to the presence of phenolic compounds but it was not the only active compound. Thin layer chromatography also helped to show that the majority of antioxidant compounds were polar, in these were always revealed the presence of phenolic compounds, and in some bands, also the presense of flavonoids. Non-polar metabolites were observed in all chromatograms of extracts. In some cases they could be associated with phenolic compounds while in others could be associated to non-phenolic metabolites. In G. sordulenta it was found that the antioxidant activity was preferentially associated to flavonoid compounds. Antigenotoxic properties of fruiting bodies and mycelia from liquid cultures of G. gargal, as well as grains of wheat flour fermented with G. gargal, G. sordulenta and/or G. frondosa were also studied to test somatic mutation and recombination in Drosophila melanogaster. The chemical agent used to cause mutations (promutagen) was DMBA (7-12-dimethylbenz (α) anthracene). Research on toxicity revealed that treatment with DMBA increased larval mortality from 9 to 45%. Still, when fungal extracts were added larval mortality rate decreased. Both mutation and recombination were assessed as the number of white spots per hundred eyes, showing an increased frequency in the treatments with DMBA, and a decrease in co-treatments with both: DMBA and fungal extracts in the following order: G. gargal fruiting body, three grain meals colonized and G. gargal liquid culture mycelium. It could be concluded that the material evaluated was not toxic and that in combination with procarcinogenic promutagenic DMBA both mortality and genotoxicity decreased. The protective response observed with fungal materials triggered detoxification mechanisms in D. melanogaster larvae which could be either desmutagenic or bioantimutagenic and which could be produced due to some bioactive compounds present in higher fungi with antigenotoxic activity, such as phenolics, linoleic acid, polysaccharides and polypeptides. Summing up, findings on the absence of genotoxicity and antioxidant and antigenotoxic properties, in the fungal species studied in this Ph.D. thesis, will be greatly benefited from further research on the optimization of both species for the production of fruiting bodies through fermentation in the solid state. In the meantime, the production of mycelia and metabolites in liquid culture medium is the alternative for such optimitization. A final section of this Ph.D. thesis includes information on the mineral content of different nutrients which were analyzed in samples of mycelium and fruiting bodies and colonized wheat grains. A novelty with biotechnological potential derived from this section concerns the obtention of wheat flour colonized by these fungi, which evidenced factibility of being used as functional nutrient.
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