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Título : Metabolitos con actividad antioxidante en representantes de la flora regional
Autor(es) : Rodriguez, Silvana Andrea
Director(es) : Murray, Ana Paula
Palabras clave : Química; Flora; Antioxidantes; Actividad antioxidante; Metabolitos; Bahía Blanca (Argentina)
Resumen : En el presente trabajo de tesis doctoral se trabajó con tres especies vegetales recolectadas en la región de Bahía Blanca, Provincia de Buenos Aires. Estas especies fueron seleccionadas en función de resultados preliminares de actividad antioxidante, escasez de reportes fitoquímicos en bibliografía y/o uso tradicional medicinal. Las plantas estudiadas son Limonium brasiliense y Schinus areira, plantas nativas de uso medicinal, y Atriplex undulata, una planta silvestre y endémica de la región. Considerando el creciente interés por antioxidantes de origen natural, se propuso realizar en primer lugar, el estudio químico bioguiado de los extractos de L. brasiliense y A. undulata y los aceites esenciales de A. undulata y S. areira, para luego evaluar cuantitativamente su actividad antioxidante. El fraccionamiento bioguiado de los extractos permitió aislar treinta y cuatro compuestos activos, mediante distintas técnicas cromatográficas. Para la identificación y caracterización de los compuestos se emplearon distintos métodos espectroscópicos (RMN de 1H y 13C con experimentos 1D y 2D y espectrometría de masas). Dos de los compuestos aislados resultaron ser compuestos nuevos, sin antecedentes en la bibliografía. A continuación se realizaron distintos ensayos de actividad biológica para las muestras en estudio (extractos, subextractos, aceites esenciales y compuestos puros). En primer lugar se realizaron ensayos de citotoxicidad en líneas celulares humanas y de ratón, para definir qué muestras resultaban no tóxicas (95% viabilidad celular a 24 h) y a qué concentraciones se podían realizar los distintos ensayos celulares. Se evaluaron los efectos inhibidores de los extractos, aceites esenciales y compuestos activos aislados sobre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Se cuantificó la liberación intracelular y extracelular de ROS en neutrófilos y en macrófagos, utilizando los estimulantes apropiados para detectar la explosión respiratoria extracelular e intracelular, respectivamente. También se pudo observar una importante actividad antiinflamatoria a través de la inhibición de importantes mediadores de la inflamación, como el óxido nítrico (NO) y la expresión de las enzimas óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y ciclooxigenasa‐2 (COX‐2) y la liberación de las citoquinas proinflamatorias, interleucina IL‐1β y factor de necrosis tumoral (TNF‐α), por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT‐PCR). Luego, se procedió al estudio de la actividad antimicrobiana de los extractos, aceites esenciales y compuestos activos aislados, determinando la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM) frente a once bacterias patógenas, un hongo (Candida albicans) y un parásito (Trichomonas vaginalis), microorganismos patógenos de importancia clínica y alimentaria, utilizando el método de microdilución en caldo. Finalmente, se evaluó la capacidad antimutagénica y antipromutagénica, in vitro y ex vivo, de los extractos, aceites esenciales y compuestos activos aislados mediante el ensayo de Ames utilizando tres cepas de Salmonella typhimurium (TA98, TA100 y TA102), contra diferentes mutágenos (azida de sodio, 2,4,7‐trinitro‐9‐fluorenona, t‐BuOOH y H2O2), con o sin activación metabólica exógena (fracción S9 de hígado de rata). Las muestras evaluadas fueron capaces de reducir o inhibir las lesiones en el ADN o mutaciones que inducen las células de cáncer y enfermedades causadas por agentes genotóxicos. Los resultados de esta tesis aportan evidencia de que los extractos, subextractos y aceites esenciales de las plantas estudiadas, podrían ser utilizados como fuente potencial de agentes antimicrobianos, antioxidantes, antimutagénicos y/o quimiopreventivos naturales seguros y eficientes en las industrias farmacéutica y alimentaria. Los compuestos activos aislados pueden transformarse en compuestos líderes para el desarrollo de nuevas drogas que mejoren el tratamiento de varias enfermedades, ya que la terapia antioxidante ayudará a evitar la degeneración neuronal y el envejecimiento celular causados por los radicales libres.
Three species collected in Bahía Blanca, Buenos Aires province, were selected and studied in this thesis. Preliminary studies of antioxidant activity, lack of previous phytochemicals reports and/or traditional medicinal use, were the criteria applied for the selection of these plants. Limonium brasiliense and Schinus areira, are native medicinal plants, while Atriplex undulata is a wild and endemic species. Taking into accounts the growing interest in natural antioxidants, it was proposed to study the chemical profile of L. brasiliense and A. undulata extracts, as well as, the essential oils obtained from A. undulata and S. areira, following a bioguided approach and then, assess their antioxidant activity in a quantitative way. The bioassay guided fractionation of the extracts rendered thirty four active compounds, isolated by different chromatographic techniques that were identified and characterized by 1H‐ and 13C‐NMR (1D and 2D experiments) and mass spectrometry. Two of them resulted to be new compounds, with no previous record in the literature. Then, several biological activities were evaluated for all the samples studied (extracts, sub‐extracts, essential oils and pure compounds). First of all, cytotoxicity in human and mouse cell lines was assessed in order to define which samples were safe (95% cellular viability at 24 h) and which concentrations could be applied for the cellular assays. The inhibitory effects over the production of reactive oxygen species (ROS) were evaluated for all the samples. Release of intracellular and extracellular ROS was quantified in neutrophils and macrophages, with the appropriate stimulants to detect respiratory explosion. Also, an important anti‐inflammatory activity was observed through the inhibition of relevant inflammation mediators like nitric oxide (NO), the expression of inducible nitric‐oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase‐2 (COX‐2) and the release of the pro‐inflammatory cytokines, interleukin IL‐1β and tumor necrosis factor (TNF‐α), by reverse transcriptase‐polymerase chain reaction (RT‐PCR). Additionally, the antimicrobial activity of the extracts, essential oils and pure compounds was assessed by determining the minimum inhibitory concentration (CIM) and minimum bactericidal concentration (CBM) against eleven pathogen bacteria, one fungus (Candida albicans) and one parasite (Trichomonas vaginalis), all of them pathogen microorganism of clinic and food importance, using the broth microdilution method. Finally, antimutagenic and antipromutagenic activity were evaluated in vitro and ex vivo, using the Ames assay with three strains of Salmonella typhimurium (TA98, TA100 y TA102) with and without exogenous metabolic activation (rat liver fraction S9), against different mutagens (sodium azide, 2,4,7‐trinitro‐9‐fluorenone, t‐BuOOH and H2O2). It was observed that the samples were able to reduce or inhibit DNA damage or mutations induced by cancer cells and disease caused by genotoxic agents. The results of this thesis probe that the extracts, sub‐extracts and essential oils of the studied plants could be useful as potential source of natural, safe and efficient antimicrobial, antioxidant, antimutagenic and/or chemo preventive agents, for pharmaceutical or food industries. Active compounds that were isolated here could became leader compounds for the development of new drugs to improve the treatment of several diseases, since the antioxidant therapy will help to avoid neuronal degeneration and cellular aging that free radicals provoke.
URI : http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/4302
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