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Título : Estudio de la movilización intracelular del hierro y su desregulación
Autor(es) : Giorgi, Gisela
Director(es) : Roque, Marta Elena
Palabras clave : Bioquímica; Hierro; Sobrecarga; Deficiencia; Modelo animal
Fecha de publicación : 2016
Resumen : En este trabajo de tesis se estudió la fisiología y fisiopatología del metabolismo del hierro. En células hepáticas, duodenales, renales, pancreáticas, pulmonares y neuronales se evaluaron proteínas que movilizan hierro a través de las membranas celulares en estados de balance de hierro y sus cambios regulatorios en la dishomeostasis del biometal. Se utilizaron Modelos Animales de Sobrecarga y de Deficiencia de Hierro y una línea celular de neuroblastoma humano para el estudio de las proteínas importadoras de hierro Transportador de Metales Divalentes 1 (DMT1), ZIP14 (SLC39A14) y Receptor de Transferrina 1 (RTf1); las proteínas reguladoras Proteína de la Hemocromatosis (HFE), Proteína Reguladora del Hierro 1 (IRP1) y Prohepcidina; la proteína exportadora Ferroportina (FPN) y la proteína de depósito Ferritina. Metodologías: histoquímica, inmunohistoquímica y técnicas de biología molecular (EMSA, Western blot y RT-PCR). Se desarrollaron: 1) Modelos Animales Murinos (ratones CF1; n=6/grupo): a) Sobrecarga de Hierro: hierro sacarato; control (solución fisiológica); b) Deficiencia de Hierro: flebotomía; control (operación simulada); 2) Células SH-SY5Y con/sin N-acetilcisteína y células SH-SY5Y knockdown para IRP1 fueron tratadas con IL-6, TNF-α, LPS y solución salina. Deficiencia de Hierro: la expresión apical de DMT1 en enterocitos y su débil expresión en hepatocitos mostraron un mecanismo que estimula la absorción de hierro de la dieta y disminuye la captación hepática. La expresión apical de DMT1 y RTf1 y la débil expresión de Prohepcidina en células tubulares proximales renales evidencian aumento de la captación renal de hierro en coordinación con duodeno. El aumento de RTf1 y la localización apical de DMT1, HFE y FPN en las células bronquiales les adjudican a estas proteínas funciones en la captación y en el control de hierro para suministrar hierro al pulmón. Prohepcidina pulmonar no regularía la movilización del hierro en pulmón en deficiencia. Sobrecarga de hierro: la localización perinuclear de DMT1 en enterocitos y su intensa expresión en hepatocitos mostraron un mecanismo regulatorio que limita la absorción de hierro de la dieta y aumenta su captación hepática. El aumento de ZIP14 y su localización apical en células proximales evidencian una mayor reabsorción renal de hierro que produce sobrecarga de hierro en el riñón, mecanismo que predomina sobre la función de DMT1 y RTf1. El aumento de ZIP14 y FPN y la localización apical de DMT1 y Ferritina en las células bronquiales les adjudican a estas proteínas funciones en la captación, exportación y almacenamiento de hierro para detoxificar el exceso de hierro. Prohepcidina pulmonar no regularía la movilización del exceso de hierro en pulmón. La disminución de DMT1 y Ferritina y el aumento de Prohepcidina en las células del islote de Langerhans mostraron un mecanismo que limitaría la acumulación del hierro en las células endocrinas, siendo las células de reserva de hierro las del acino y del tejido conectivo. Modelo de Inflamación: el aumento de DMT1 en las células SH-SY5Y inducido por citoquinas y LPS le adjudica a DMT1 una función en la captación de hierro. El aumento de DMT1 sería controlado principalmente por una regulación transcripcional mediada por ROS. La activación de IRP1 independiente de ROS no sería un mecanismo regulatorio predominante sobre el aumento de DMT1 en inflamación. El empleo del antioxidante NAC revierte el efecto de la inflamación sobre el aumento de DMT1, por lo que NAC podría disminuir la captación de hierro en células de neuroblastoma. Finalmente podemos concluir que en Deficiencia de Hierro existen mecanismos regulatorios de las proteínas del hierro en duodeno, hígado, riñón y pulmón que suministran el hierro tisular o sistémico requerido en alta demanda. En Sobrecarga de Hierro, la regulación de las proteínas en duodeno e hígado disminuiría el hierro biodisponible. En pulmón y páncreas, las proteínas del hierro participarían de un mecanismo beneficioso para limitar el daño oxidativo de las células del pulmón y del páncreas endocrino en Sobrecarga de Hierro. En cambio, en el riñón, la regulación de ZIP14 originaría la sobrecarga de hierro en los túbulos proximales que induciría daño celular. En Inflamación DMT1 contribuiría a la captación de hierro libre en las células neuronales a través de una regulación principalmente transcripcional mediada por ROS, siendo esta función de DMT1 revertida por el agregado de antioxidantes. En conclusión, la relación entre las proteínas del hierro en diferentes células en modelos animales puede ayudar a comprender mejor los mecanismos implicados en la fisiología y fisiopatología del metabolismo del hierro.
The purpose of this Ph. D. thesis was to study the physiology and physiopathology of iron metabolism. To this end, proteins that mobilize iron across cell membranes in states of iron balance as well as their regulatory changes in the dishomeostasis of this biometal were analyzed in liver, duodenal, kidney, pancreatic, lung and neural cells. Animal Models of Iron Overload and of Iron Deficiency as well as a human neuroblastoma cell line were used to study iron import proteins Divalent Metal Transporter 1 (DMT1), ZIP14 (SLC39A14) and Transferrin Receptor 1 (RTf1); regulators proteins Hemochromatosis Protein (HFE), Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) and Prohepcidin; export protein Ferroportin (FPN) and storage protein Ferritin. Methodologies: histochemistry, immunohistochemistry and molecular biology techniques (EMSA, Western blot and RT-PCR). The following were developed: 1) Murine Animal Models (CF1 mice; n=6/group): a) Iron Overload: iron saccharate, control (physiological solution), b) Iron Deficiency: phlebotomy, control (sham-operated); 2) SH-SY5Y cells with/without N-acetylcysteine and SH-SY5Y knockdown cells for IRP1 were treated with IL-6, TNF-α, LPS and saline solution. Iron Deficiency: the apical expression of DMT1 in enterocytes and its weak expression in hepatocytes revealed a mechanism which stimulates iron absorption from the diet and reduces liver uptake. The apical expression of DMT1 and RTf1 as well as the weak expression of Prohepcidin in renal proximal tubular cells were observed to evidence an iron uptake increase in coordination with the duodenum. The increase in RTf1 as well as the apical localization of DMT1, HFE and FPN in bronchial cells were found to be indicative of proper functions of these proteins of iron uptake and control to supply iron to the lungs. Pulmonary Prohepcidin seemed not regulate iron mobilization in the lung under deficiency conditions. Iron overload: perinuclear DMT1 localization in enterocytes as well as its intense expression in hepatocytes were found to be indicative of a regulatory mechanism that restricts dietary iron absorption but increases its hepatic uptake. ZIP14 increase and its apical localization in proximal cells were observed to show a higher renal iron reabsorption producing, in turn, iron overload in the kidney, this being a mechanism that predominates over DMT1 and RTf1 function. ZIP14 and FPN increase and DMT1 and Ferritin apical localization in bronchial cells were observed to confer these proteins functions in iron uptake, export and storage for iron excess detoxification. Pulmonary Prohepcidin seemed not to regulate iron excess mobilization in the lung. DMT1 and Ferritin decrease and Prohepcidin increase in the islet of Langerhans cells revealed a mechanism which appeared to restrict iron accumulation in endocrine cells, iron reserve cells being those of the acinus and connective tissue. Model of Inflammation: cytokine- and LPS-induced increase of DMT1 in SH-SY5Y cells was found to confer DMT1 an iron uptake function. DMT1 increase could be controled mainly by a ROS-mediated transcriptional regulatory mechanism. ROS-independent IRP1 activation seemed not to behave as a predominant regulatory mechanism over DMT1 increase under inflammation conditions. The use of NAC antioxidant was found to reverse the effect of inflammation on DMT1 increase, this being the reason why NAC could reduce iron uptake in neuroblastoma cells. Taken together, results from this Ph. D. thesis lead us to conclude that under Iron Deficiency conditions iron-protein regulatory mechanisms supply highly required tissular or systemic iron in duodenum, liver, kidney and lung. Under Iron Overload conditions, protein regulation seems to reduce bioavailable iron in duodenum and liver. In the lung and pancreas, iron proteins may be part of a beneficial mechanism to reduce the oxidative damage of lung cells and endocrine pancreas under Iron Overload conditions. In contrast, in the kidney, ZIP14 regulation seems to give rise to Iron Overload in proximal tubules, thus inducing cell damage. Under Inflammation conditions, DMT1 appears to contribute to the uptake of iron-free in neuronal cells mainly through a ROS-mediated transcriptional regulatory mechanism, this particular function of DMT1 being reversed by the addition of antioxidants. In conclusion, the relationship between the iron proteins in different cells in animal models may help to better understand the mechanisms involved in the physiology and physiopathology of iron metabolism.
URI : http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/2659
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