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Título : Estudios de identificación y caracterización de agentes contaminantes virales en colonias de cría de ratones
Autor(es) : Maiza, Andrea Soledad
Director(es) : Ambrosio, Ana María
Roque, Marta Elena
Palabras clave : Bioquímica; Ratones SPF; Virus contaminantes de roedores; Enzimoinmunoanálisis; Inmunofluorescencia indirecta
Fecha de publicación : 2013
Resumen : Se conoce ampliamente que la confiabilidad de una colonia de cría de ratones para un determinado experimento puede ser solamente demostrada mediante un comprensivo monitoreo del estado de salud de los animales antes y durante el experimento. En este trabajo se han desarrollado las técnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y enzimoinmunoensayo (ELISA) para la detección de anticuerpos contra el virus Sendai, virus de la hepatitis murina y el virus diminuto o minuto de ratón en las colonias de cría del ratón, considerados los agentes virales más prevalentes en las colonias SPF de ratones. Se estudió la cinética de replicación para cada virus mediante la cosecha de células y sobrenadantes respectivos, en diferentes días post inoculación (pi).Se obtuvo una Semilla Maestra y una Semilla de Trabajo para el virus Sendai mediante la inoculación del virus en huevos embrionados de pollo. La Semilla de Trabajo sin diluir y en diluciones factor de 10 se utilizó para inmunizar a los ratones con diferentes esquemas de inoculación. Los sueros y líquidos ascíticos presentaron títulos de anticuerpos específicos entre 64 y 256, por la inhibición de hemaglutinación (HAI) y IFI, mientras que los títulos por ELISA estuvieron entre 6400 y 204800, para las mismas muestras. Para el virus MHV la Semilla Maestra y la Semilla de Trabajo se obtuvo por inoculación del virus en monocapas de células L929. Diluciones factor 10 de la cepa viral MHV se utilizó para inmunizar a los ratones con diferentes esquemas de inoculación. Los sueros y líquidos ascíticos presentaron títulos de anticuerpos específicos entre 32 y 2048 por IFI, mientras que los títulos por ELISA estuvieron entre 3200 y 12800 para los sueros y entre 200 y 6400 para los líquidos ascíticos, para las mismas muestras. Para el virus MVM la Semilla Maestra y la Semilla de Trabajo se obtuvo por inoculación del virus en monocapas de células L929. Diluciones factor 10 de la cepa viral MVM y de la ST viral se utilizó para inmunizar a los ratones con diferentes esquemas de inoculación. Los sueros y líquidos ascíticos se presentaron títulos de anticuerpos específicos entre 32 y 128 por inmunofluorescencia indirecta (IFI), mientras que los títulos por ELISA estuvieron entre 1600 y 6400 para los sueros y entre 200 y 800 para los líquidos ascíticos, para las mismas muestras. El antígeno para la pruebas IFI consistió en células enteras, mientras que para las pruebas de ELISA fue células lisadas por sonicación. Para el virus Sendai ambos antígenos se obtuvieron por inoculación de 0,1 UHA de la ST en células LLCMK2 y se cosechó el día 7pi. Para el virus MHV se inoculó ~105 DICT 50 / mL y para el virus MVM ~10 6DICT 50 / mL, en células L929. Las células fueron procesadas el día 5 y 1 pi respectivamente. Nuestros estudios muestran que el desarrollo de las pruebas de IFI y ELISA, (complementadas con la prueba clásica de HAI para el caso del virus Sendai), comprenden una batería de pruebas innovadoras y confiables para la detección de anticuerpos contra los virus de Sendai, MHV y MVM en bioteros. Los resultados presentados revelan que las metodologías desarrolladas en nuestro laboratorio son herramientas eficaces para el control de la contaminación por los agentes virales estudiados en colonias de ratones libres de patógenos específicos. Los estudios presentados podrían considerarse como un punto de partida para el desarrollo de futuros avances en este campo del conocimiento. Palabras claves: ratones SPF, virus contaminantes de roedores , enzimo inmuno análisis (ELISA), inmunofluorescencia indirecta (IFI)
It is widely known that the reliability of a mouse breeding colony for a given experiment only can be demonstrated by a comprehensive health monitoring of the animals before and during the experiment. We recommend finding specific antibodies as indicators of virus circulation in the colony. In this work, we developed the techniques of indirect immunofluorescence (IFI) and enzyme immunoassay (ELISA) for the detection of antibodies to Sendai virus, MHV virus and MVM virus in mouse breeding colonies. It was studied the kinetics for each virus replication by harvesting cells and its respective supernatants at different days post inoculation (pi). It was generated both a master sample and a working sample by inoculation of Sendai virus in embryonated chicken eggs. The working sample undiluted and 10-fold serial dilutions were used to immunize mice following different schemes of inoculation. Serum and ascitic fluid samples were collected and showed titers of specific antibodies between 64 and 256, by hemaglutination inhibition (HAI) and IFI, whereas serum and ascitic fluid samples showed titers between 6400 and 204800, by ELISA. The master sample for MHV virus and Working sample was obtained by inoculation of the virus in L929 cell monolayers. The MHV virus 10- fold serial dilutions were used to immunize mice following different schemes of inoculation. Serum and ascitic fluids samples were collected and specific antibody titers between 32 and 2048 by IFI, while ELISA titers were between 3200 and 12800 for the serum and 200 to 6400 for ascitic fluids samples, for the same samples. The master sample for MVM virus and Working sample was obtained by inoculation of the virus in L929 cell monolayers. The working sample and 10-fold serial dilutions of MVM virus were used to immunize mice following different schemes of inoculation.Serum and ascitic fluids samples were collected and specific antibody titers between 32 and 128 by indirect IFI, while ELISA titers were between 1600 and 6400 for serum and 200 to 800 for ascites fluids samples, for same samples. The antigen for IFA tests consisted of whole cells, while for the ELISA was lysed cells by sonication. Sendai virus for both antigens was obtained on day 7pi in LLCMK2 cells by inoculation of 0.1 UHA of working sample. For MVM virus was inoculated ~10 6DICT 50 / mL and MHV was inoculated ~105 DICT 50 / mL. They were processed L929 cells and used on day 1 and 5pi respectively. Our results show that the development of specific IFI and ELISA, (complemented by the classical test of HAI for Sendai virus), comprise a battery of innovative and reliable tests for the detection of antibodies against Sendai virus, MHV virus and MVM virus in laboratory mice. These initial data reveal that both tests might be efficient tools for the monitoring of contamination by these viral agents in colonies of specific pathogen free mice. The studies presented could be considered as a starting point for the development of future advances in this field of knowledge. Keywords: specific pathogen free mice, rodent virus contaminantion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoflurescence assay (IFI)
URI : http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/2434
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