Efecto de las variaciones en los niveles de lípidos sobre el tráfico y propiedades del receptor de acetilcolina nicotínico en células CHO

Abstract

La superfamilia de canales iónicos activados por ligandos (en inglés ligand gated ion channels, LGIC) incluye al receptor de acetilcolina nicotínico (AChR, neuronal y muscular), los receptores del ácido γ-amino butírico (GABAAR), el receptor de glicina (GlyR) y el subtipo 3 de los receptores de serotonina (5-HTR3). Dentro de esta superfamilia, el AChR es uno de los receptores mejor caracterizados y constituye el prototipo de los LGIC. El AChR muscular es un oligómero heteropentamérico compuesto por dos subunidades α y tres subunidades adicionales β, γ y δ, en una estequiometría α2βγδ en el AChR muscular fetal, mientras que en el adulto la subunidad γ es reemplazada por la subunidad ε. Este receptor se encuentra en la membrana postsináptica de la unión neuromuscular. La unión de su agonista natural, la acetilcolina (ACh) causa la activación del AChR, provocando un cambio conformacional en la proteína, con rápida apertura del canal y la entrada de iones sodio al interior celular. Debido a que el AChR es una proteína integral de membrana plasmática, sus dominios hidrofóbicos transmembrana se hallan en contacto con los lípidos presentes en la bicapa. Estos lípidos interaccionan con diversos dominios del receptor modulando su funcionalidad. En esta Tesis estudiamos los efectos promovidos por alteraciones en los niveles de lípidos celulares tales como el colesterol, la esfingomielina o ceramidas, sobre la síntesis y el tráfico del AChR, así como también sobre su afinidad por ligandos y estabilidad en la membrana plasmática. Todos estos parámetros fueron evaluados utilizando como modelo experimental a las células CHO-K1/A5, una línea celular desarrollada en nuestro laboratorio que expresa en forma heteróloga estable el AChR de tipo muscular adulto (α2βδε). En primer lugar, evaluamos los efectos de la depleción metabólica crónica del colesterol por la droga Mevinolina, potente inhibidor de la enzima microsomal 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa, enzima limitante en la biosíntesis de colesterol. Se logró determinar que cuando los niveles de colesterol celular son disminuidos por acción de esta droga, el número de AChRs presentes en la membrana plasmática de células CHO-K1/A5 sufre una drástica disminución (46%), con un aumento concomitante en el número de receptores intracelulares. Dichas variaciones se produjeron por inhibición del tráfico exocítico de la proteína con la consecuente retención del AChR a nivel del TGN. De igual modo, observamos que en condiciones controles el AChR se localiza parcialmente en membranas resistentes a detergentes (DRMs o balsas lipídicas) de retículo endoplasmático y Golgi, y que la depleción del colesterol afecta esta distribución, disminuyendo la proporción de AChRs presentes en dichos dominios de membrana. En conjunto, estos resultados nos permitieron concluir que el colesterol modula el transporte de nuevos AChRs hacia la superficie celular, a través de la asociación de dichos receptores con plataformas lipídicas enriquecidas en colesterol. En segundo lugar, estudiamos los efectos ejercidos por las ceramidas, precursoras en la síntesis de esfingolípidos, sobre diferentes propiedades del AChR. Las células se incubaron con diferentes concentraciones de ceramidas de corta o larga cadena, o bien se expusieron a la incubación con esfingomielinasa para evaluar los efectos promovidos por la generación de ceramidas endógenas. Se logró demostrar la efectividad de las ceramidas en modular no sólo el tráfico del AChR sino también su afinidad por ligandos. En cuanto al tráfico del receptor, se demostró que las ceramidas ejercen una modulación dual de este proceso, aumentando o disminuyendo el número de AChRs en la superficie celular, dependiendo de la concentración de lípido utilizada. Con respecto a la afinidad del AChR por el ligando αBTX, se observó un aumento de la misma cuando las células son incubadas a altas concentraciones (25 ó 37.5 μM) de ceramidas, mientras que a bajas concentraciones del lípido (5 μM) no se produjeron tales cambios. Finalmente, se determinó que la generación de ceramidas endógenas por tratamiento con esfingomielinasa también fue efectiva en promover la disminución de los niveles de AChR en la membrana celular, a través del aumento en la tasa de endocitosis del receptor.

The ligand-gated ion channel superfamily (LGIC) comprises the nicotinic acetylcholine receptor (AChR, neuronal and muscle-types), the γ-amino butyric acid receptor (GABAAR), the glycine receptor (GlyR) and the serotonin receptor subtype 3 (5-HTR3). Within this superfamily, the AChR is the best characterized and is considered as the prototype LGIC. The muscle AChR is an heteropentamer composed of two α subunits and three additional subunits (β, γ, δ) in the stoichiometry α2βγδ (in the foetal AChR) whereas in the adult receptor form the γ subunit is replaced with the ε. This receptor is present at the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction. The binding of its natural agonist, acetylcholine (ACh), leads to the activation of the AChR, causing a conformational change in the protein, with the rapid aperture of the channel and the entry of sodium ions inside the cell. On account of the fact that the AChR is an integral membrane protein, its hydrophobic transmembrane domains are in close contact with the bilayer lipids. These lipids interact with various domains of the receptor, thereby modulating its functionality. In the present Thesis we study the effects exerted either by alterations of cellular lipids such as cholesterol, sphingomyelin, or ceramides, on the synthesis and trafficking of the AChR, as well as on its affinity for ligands and stability in the plasma membrane. All these parameters were evaluated using, as experimental model, CHO-K1/A5 cells, a cell line developed in our laboratory that heterologously express the adult form of the AChR (α2βδε). Firstly, we evaluated the effects of chronic metabolic cholesterol depletion elicited by the drug Mevinolin, a potent inhibitor of the microsomal enzyme, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase, the limiting enzyme in cholesterol biosynthesis. We determined that when cellular cholesterol levels decrease, the number of AChRs present at the plasma membrane of CHO-K1/A5 cells undergo a drastic diminution (46%), with the concomitant increase in the number of intracellular receptors. These variations are due to an inhibition of the exocytic traffic of the protein with the consequent retention of the AChR at the level of the TGN. In addition, we observed that under control conditions the AChR is partially localized in detergent-resistant membranes (DRMs) obtained from the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus, and that cholesterol depletion affects such distribution, decreasing the proportion of AChRs present in those membrane domains. Altogether, these results lead us to conclude that cholesterol modulates the transport of newly synthesized AChRs to the cell surface by association of these receptors with lipid platforms enriched in cholesterol. Secondly, we studied the effects exerted by ceramides, precursors in the synthesis of sphingolipids, on different properties of the AChR. To this end, the cells were either incubated with different concentrations of short-chain or long-chain ceramides or exposed to incubation with sphingomyelinase in order to evaluate the effects exerted by the generation of endogenous ceramides. We demonstrate the effectiveness of ceramide treatment in modulating not only AChR trafficking but also receptor affinity for ligands. With respect to receptor trafficking, we demonstrate that ceramides modulate this process in a dual manner, either augmenting or decreasing the number of AChRs present at the cell surface depending on the lipid concentration. In addition, we observed that the affinity of the AChR for the ligand αBTX increased when cells were incubated with high ceramide concentrations (25 or 37.5 μM). In contrast, low ceramide concentrations (5 μM) exerted no such changes. Finally, we determined that the generation of endogenous ceramides by treatment of cells with sphingomyelinase also effectively decreased AChR levels at the cell membrane by enhancing receptor endocytosis.