Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem: http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/1947
Título : "Estudios bioquímicos y biofísicos de la interacción del receptor de acetilcolina nicotínico con ácidos grasos libres y esteroides"
Autor(es) : Fernández Nievas, Gaspar Antonio
Director(es) : Barrantes, Francisco J.
Palabras clave : estudios biofísicos; estudios bioquímicos; ácidos grasos; BIOLOGIA E FISIOLOGIA DOS MICROORGANISMOS
Fecha de publicación : 2009
Resumen : Esta Tesis estudia al receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) de Torpedo californica, una proteína integral de membrana compuesta por cinco subunidades homólogas organizadas en forma pseudosimétrica formando un poro de canal central, con una estequiometria α2βγδ. Cada subunidad contiene un dominio extracelular amino terminal, cuatro segmentos hidrofóbicos transmembrana (M1-M4) conectados por lazos de longitud variable, y un pequeño dominio carboxilo terminal. Los segmentos transmembrana de cada subunidad están organizados en tres anillos concéntricos. Los segmentos M2 forman las paredes del canal, los segmentos M1 y M3 constituyen el anillo medio, y los segmentos M4 forman el anillo externo, en íntimo contacto con los lípidos de membrana. La función del AChR es modulada por distintos compuestos que actúan como inhibidores. Los inhibidores competitivos se unen a los mismos sitios que el agonista; los no competitivos lo hacen en sitios diferentes. La interfase lípido-proteína ha sido foco de gran interés como potencial sitio de acción de un grupo de inhibidores no competitivos (NCI) de baja afinidad que comparten la característica de ser altamente hidrofóbicos. Se ha demostrado que distintos ácidos grasos libres (AGL) y esteroides modulan la funcionalidad del AChR a través de un mecanismo de inhibición no competitiva. Dos posibles hipótesis han sido propuestas para explicar tal mecanismo de acción. Una propone un efecto indirecto, considerando que la presencia de estos compuestos en el micro-ambiente lipídico del AChR perturba las propiedades biofísicas de la membrana, lo cual a su vez conduciría a cambios conformacionales de la proteína AChR. La otra hipótesis propone una acción directa: la interacción del compuesto exógeno con el AChR resultaría en forma directa en cambios conformacionales del AChR o en el desplazamiento de lípidos esenciales de su micro-entorno, esenciales para su correcta función. En el Capítulo I de esta Tesis se utilizó espectroscopía de fluorescencia, particularmente la técnica de transferencia de energía resonante de tipo Förster (FRET). Se evaluaron cambios en la eficiencia del proceso de FRET (E) entre el AChR, que actúa como donante de fluorescencia, y la sonda fluorescente Laurdan, que actúa como aceptor: la disminución de la E sugirió que el aceptor es desplazado del micro-entorno lipídico del AChR por la presencia de moléculas lipídicas exógenas. De esta manera, se pudo demostrar la localización de diferentes esteroides y AGL en el micro-ambiente lipídico del AChR. En el Capítulo II de esta Tesis se utilizó la sonda fluorescente cristal violeta, que posee mayor afinidad por el estado desensibilizado del AChR que por su estado de reposo. Se concluyó que el mecanismo de inhibición del AChR de distintos esteroides y de los AGL involucra una perturbación en el equilibrio conformacional del AChR. Además, utilizando la sonda fluorescente Laurdan, y calculando la denominada "polarización generalizada" de esta sonda, pudo relacionarse los efectos que estos compuestos ejercen sobre las características biofísicas de la membrana con el estado conformacional del AChR.
This Thesis concerns the study of the nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica, an integral membrane protein composed by five homologous subunits pseudo-symmetrically organized around a central pore with the stoichiometry α2βγδ. Each subunit contains an extracellular amino-terminal domain, four hydrophobic transmembrane segments (M1-M4) connected by loops of varying length, and a short extracellular carboxyl terminal domain. The transmembrane segments of each subunit are arranged in three concentric rings. The M2 segments form the walls of the ion channel, the segments M1 and M3 constitute the middle ring, and the M4 segments form the outer ring, in close contact with the membrane lipids. The AChR function is modulated by different compounds that act as inhibitors. Competitive inhibitors bind to the same sites to which agonist bind; non-competitive inhibitors bind to different sites. The lipid-protein interface has been the focus of great interest as a potential site of action of a group of low-affinity non-competitive inhibitors (NCI) that share the property of being highly hydrophobic. It has been demonstrated that free fatty acids (FFA) and different steroids modulate the AChR functionality by a non-competitive inhibition mechanism. Two possible hypotheses have been proposed to explain the mechanism of action of these NCI on the AChR. One proposes an indirect mechanism, suggesting that the presence of exogenous compounds at the AChR lipid microenvironment perturbs the biophysical properties of the membrane, which, in turn, leads to conformational changes of the AChR protein. The other hypothesis proposed a direct action: the interaction of the exogenous compound with the AChR would result in AChR conformational changes or cause the displacement of essential lipids from the AChR microenvironment, which are necessary for its correct functionality. In the first Chapter of this Thesis, use was made of fluorescence spectroscopy, in particular Förster-type resonance energy transfer (FRET). Changes of the energy transfer efficiency (E) between the AChR, the fluorescence donor, and the fluorescent probe Laurdan, the acceptor, were evaluated: The diminution of E suggested that the acceptor is displaced from the AChR lipid micro-environment by the presence of the exogenous lipid molecules. Thus, the localization of different steroids and FFA could be established at the AChR lipid micro-environment. In the second Chapter of this Thesis, use was made of the fluorescent probe crystal violet, which exhibits higher affinity for the AChR desensitized state than for the AChR resting state. The conclusion was reached that the inhibitory mechanism of different steroids and FFA involves a perturbation of the conformational equilibrium of the AChR. Furthermore, by using the probe Laurdan and by calculating the so-called "generalized polarization" of this probe, it was possible to correlate the effects of these compounds on the biophysical properties of the membrane with the conformational state of the AChR.
URI : http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/1947
Aparece en las colecciones: Tesis de postgrado

Ficheros en este ítem:
Fichero Tamaño Formato  
Tesis Doctoral Fernandez Nievas.pdf805,75 kBAdobe PDFVisualizar/Abrir