"Métodos analíticos automáticos para el control de calidad de productos farmacéuticos"

Abstract

La tendencia actual de los Laboratorios de Control de Calidad es la implementación de métodos analíticos versátiles, rápidos, sensibles, precisos, simples, fáciles de operar y de bajo costo. Una de las maneras más efectivas de alcanzar tales características es la automatización. En este trabajo de tesis se presenta el desarrollo de métodos analíticos automáticos basados en el Análisis por Inyección en Flujo (FIA) y la novedosa metodología Flow-Batch (FB). En la primera parte del trabajo se realizó la cuantificación de dos catecolaminas: levodopa (LVD) y carbidopa (CBD). Las mismas se encuentran presentes en preparaciones farmacéuticas utilizadas en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. La determinación se basó en la oxidación de ambos analitos en presencia de Polifenol oxidasa. La enzima se obtuvo en el laboratorio a partir de batatas (Ipomoea batatas). La misma cataliza la oxidación de mono y difenoles a ortoquinonas en presencia de oxígeno. Las ortoquinonas se acoplan entre si produciendo pigmentos melanínicos que absorben en la región del UV-visible. La superposición espectral de los productos de reacción fue resuelta mediante la aplicación de técnicas de calibración multivariada. En base a esto, se desarrollaron dos métodos: a) Método enzimático FIA con detección espectrofotométrica para la determinación simultánea de LVD y CBD utilizando PLS. Se diseñó un sistema FIA en la modalidad flujo detenido. Se optimizaron las variables químicas y FIA del sistema. A partir de un diseño experimental central compuesto se prepararon los conjuntos de calibración y validación teniendo en cuenta la relación LVD-CBD presente en las formulaciones farmacéuticas analizadas. Los datos espectrales obtenidos fueron analizados por Mínimos Cuadrados Parciales (PLS). Los parámetros estadísticos y las figuras de mérito fueron satisfactorios para ambos analitos. Los resultados obtenidos al analizar muestras reales estuvieron en concordancia con los declarados en el rótulo del medicamento. El método se validó mediante un estudio de recuperación cuyos resultados estuvieron entre 95 y 110 % para ambos analitos. La frecuencia de muestreo fue de 22 h-1. b) Método enzimático FB con detección espectrofotométrica para la determinación simultánea de LVD y CBD utilizando PLS y MLR-SPA. Se diseñó y optimizó un sistema FB que permitió la preparación automática de los conjuntos de calibración y validación obtenidos mediante un diseño central compuesto. Los datos espectrales fueron analizados aplicando PLS y una novedosa herramienta quimiométrica: el Algoritmo de las Proyecciones Sucesivas con Regresión Lineal Múltiple (MLR-SPA). Los parámetros estadísticos y las figuras de mérito fueron altamente satisfactorios. El método desarrollado se aplicó a muestras reales obteniéndose resultados concordantes con los declarados en el rótulo del medicamento y los valores obtenidos por el método de referencia propuesto por la Farmacopea Norteamericana (HPLC). La frecuencia de muestreo fue de 18 h-1.

En la última parte de la tesis, se trabajó en la determinación cuantitativa de dopamina, noradrenalina y adrenalina en inyectables. Estas catecolaminas son utilizadas en el tratamiento de varios trastornos clínicos como hipertensión, shock, insuficiencia cardiaca, arritmias, asma, alergia y anafilaxia. En este caso, se empleó la metodología FB con detección quimioluminiscente. La determinación de estos analitos se basó en la inhibición de la quimioluminiscencia generada en la reacción entre luminol y hexacianoferrato de potasio (III) en medio alcalino. El sistema FB propuesto permite realizar la determinación de los principios activos de manera rápida dado su alto nivel de automatización. Los testigos fueron preparados en una cámara de mezclado lo que reduce significativamente el tiempo de análisis. Se utilizó un diseño experimental Box-Behnken para la optimización de las variables químicas. El cálculo de efectos permitió determinar que las tres variables analizadas y sus interacciones fueron significativas. Los parámetros estadísticos y las figuras de mérito fueron satisfactorios. El estudio de muestras reales se realizó sobre dos marcas comerciales para cada principio activo. Los resultados fueron comparados con los declarados en el rótulo del medicamento y los obtenidos por el método de referencia (HPLC) obteniéndose, en todos los casos, óptimos resultados. Los límites de detección estuvieron en el orden de ng mL-1 y la frecuencia de muestreo fue de 58 h-1.

This Thesis concerns the study of the nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica, an integral membrane protein composed by five homologous subunits pseudo-symmetrically organized around a central pore with the stoichiometry α2βγδ. Each subunit contains an extracellular amino-terminal domain, four hydrophobic transmembrane segments (M1-M4) connected by loops of varying length, and a short extracellular carboxyl terminal domain. The transmembrane segments of each subunit are arranged in three concentric rings. The M2 segments form the walls of the ion channel, the segments M1 and M3 constitute the middle ring, and the M4 segments form the outer ring, in close contact with the membrane lipids. The AChR function is modulated by different compounds that act as inhibitors. Competitive inhibitors bind to the same sites to which agonist bind; non-competitive inhibitors bind to different sites. The lipid-protein interface has been the focus of great interest as a potential site of action of a group of low-affinity non-competitive inhibitors (NCI) that share the property of being highly hydrophobic. It has been demonstrated that free fatty acids (FFA) and different steroids modulate the AChR functionality by a non-competitive inhibition mechanism. Two possible hypotheses have been proposed to explain the mechanism of action of these NCI on the AChR. One proposes an indirect mechanism, suggesting that the presence of exogenous compounds at the AChR lipid microenvironment perturbs the biophysical properties of the membrane, which, in turn, leads to conformational changes of the AChR protein. The other hypothesis proposed a direct action: the interaction of the exogenous compound with the AChR would result in AChR conformational changes or cause the displacement of essential lipids from the AChR microenvironment, which are necessary for its correct functionality. In the first Chapter of this Thesis, use was made of fluorescence spectroscopy, in particular Förster-type resonance energy transfer (FRET). Changes of the energy transfer efficiency (E) between the AChR, the fluorescence donor, and the fluorescent probe Laurdan, the acceptor, were evaluated: The diminution of E suggested that the acceptor is displaced from the AChR lipid micro-environment by the presence of the exogenous lipid molecules. Thus, the localization of different steroids and FFA could be established at the AChR lipid micro-environment. In the second Chapter of this Thesis, use was made of the fluorescent probe crystal violet, which exhibits higher affinity for the AChR desensitized state than for the AChR resting state. The conclusion was reached that the inhibitory mechanism of different steroids and FFA involves a perturbation of the conformational equilibrium of the AChR. Furthermore, by using the probe Laurdan and by calculating the so-called "generalized polarization" of this probe, it was possible to correlate the effects of these compounds on the biophysical properties of the membrane with the conformational state of the AChR.