Metabolismo de los endocannabinoides en el sistema nervioso central en procesos de envejecimiento fisiológico y patológico

Abstract

El sistema endocannabinoide es un sistema de comunicación celular que regula diversas funciones fisiológicas en una amplia variedad de células del organismo. Los principales endocannabinoides son el 2-araquidonoilglicerol (2-AG) y la anandamida (AEA). Los endocannabinoides en el sistema nervioso central (SNC) funcionan como mensajeros retrógrados. Se sintetizan en los terminales postsinápticos a partir de diferentes vías, son liberados al espacio sináptico y ejercen su efecto por unión a receptores ubicados en los terminales presinápticos, principalmente inhibiendo la liberación de neurotransmisores. Entre las numerosas funciones que tienen los endocannabinoides en el SNC, se destaca su rol neuroprotector frente a enfermedades neurodegenerativas. La Enfermedad de Alzheimer (EA) es una de las mayores causas de demencias, cuya etiología se atribuye al péptido beta amiloide (βA) que se agrega formando primeramente oligómeros y luego fibrillas que se depositan en forma de placas amiloides. Las enfermedades neurodegenerativas tienen en común que se presentan generalmente en individuos de edad avanzada por lo que se las relaciona íntimamente con el envejecimiento. Se sabe que los endocannabinoides regulan numerosos procesos celulares y moleculares relacionados con el envejecimiento. En base a esto, los principales objetivos de esta Tesis Doctoral fueron: determinar el metabolismo de los endocannabinoides en el proceso de envejecimiento fisiológico y patológico, y estudiar la modulación de este metabolismo por agonistas y antagonistas de receptores cannabinoides. Los estudios fueron realizados en fracciones de membrana y soluble, y en sinaptosomas de la corteza cerebral (CC) de rata, una de las regiones del cerebro en la que el sistema endocannabinoide ejerce su rol neuroprotector. Los resultados del metabolismo del 2-AG y de la AEA en el envejecimiento mostraron que existe una desregulación del mismo tanto en los terminales sinápticos como en las membranas de las células de la CC. Con respecto al 2-AG, se observó que su síntesis en la CC de rata se produce por la acción de las enzimas lisofosfatidato fosfohidrolasa (LPAasa) y diacilglicerol lipasa (DAGL). A su vez, la hidrólisis de este endocannabinoide en los terminales sinápticos de la CC de ratas adultas y seniles así como en membranas de ratas adultas, se produce principalmente por la acción de la enzima monoacilglicerol lipasa (MAGL). Sin embargo, en membranas de la CC de ratas seniles la enzima serina hidrolasa con dominios α/β (ABHD) sería la principal involucrada. En la CC, la desregulación del metabolismo del 2-AG observada en ratas seniles se inclina hacia una disminución de este endocannabinoide, lo cual comprometería su función neuroprotectora. En cuanto a la AEA, se determinó que su hidrólisis tanto en los terminales sinápticos como en las membranas de la CC, es a través de la enzima ácido graso amidohidrolasa (FAAH). A su vez, se observó que el envejecimiento ejerce un efecto diferente en la degradación de la AEA ya sea que se tratara de las membranas celulares o de los terminales sinápticos. En las membranas de ratas seniles, se observó que la hidrólisis de este endocannabinoide aumenta, lo cual podría comprometer la función antiinflamatoria de la AEA en la CC. Por otra parte, en los terminales sinápticos se observó que la hidrólisis de la AEA disminuye en el envejecimiento, lo cual podría proteger al cerebro frente a los daños neurodegenerativos propios de la edad. Al analizar los niveles de los receptores CB1 y CB2, se observó que ambos disminuyen en los terminales sinápticos durante el envejecimiento. Teniendo en cuenta estos resultados además de la alteración observada en el metabolismo de los endocannabinoides, se propuso evaluar la regulación de la síntesis y/o de la degradación de los endocannabinoides mediante el uso de agonistas y antagonistas de los receptores cannabinoides. Estos estudios mostraron que los antagonistas de receptores CB1 y CB2 aumentarían la disponibilidad del 2-AG y de la AEA en los terminales sinápticos de la CC de ratas seniles. Por otra parte, los agonistas de estos receptores, especialmente del CB2, aumentarían la disponibilidad de la AEA tanto en terminales sinápticos como en membranas de células de la CC de ratas seniles. Para estudiar la hidrólisis de los endocannabinoides en estadios tempranos y tardíos de la EA, se preincubaron los sinaptosomas de la CC con el péptido βA1-40 en sus conformaciones de oligómeros (etapas tempranas de la EA) y fibrillas (etapas tardías de la EA). Estos estudios mostraron que la hidrólisis del 2-AG y de la AEA disminuye en el modelo de EA temprana, por lo que los niveles de ambos endocannabinoides se verían aumentados protegiendo a la célula frente a procesos neurodegenerativos. Sin embargo, en el modelo de EA tardía, se observó que la hidrólisis de la AEA disminuye mientras que la degradación del 2-AG aumenta drásticamente comprometiendo los efectos neuroprotectores atribuidos a este endocannabinoide. En conclusión, los resultados de esta Tesis Doctoral indican que el metabolismo de los endocannabinoides se encuentra desregulado tanto en el envejecimiento fisiológico como en el patológico, lo cual pone en peligro sus funciones neuroprotectoras, y que la modulación de este metabolismo en la senescencia puede darse a través de agonistas y/o antagonistas de los receptores CB1 y/o CB2.

The endocannabinoid system is a cell communication mechanism which regulates several physiological functions in a variety of cells. 2-arachidonoylglycerol (2-AG) and anandamide (AEA) are the main endocannabinoids known to date. In the central nervous system (CNS) endocannabinoids behave as retrograde messengers. They are synthesized by different pathways in postsynaptic endings, released to the synaptic clef, and they finally exert their functions by coupling to cannabinoid receptors located in presynaptic endings, thus inhibiting neurotransmitter release. Among the several functions assigned to endocannabinoids in the CNS, is their role as neuroprotective agents against several neurodegenerative diseases. Alzheimer Disease (AD) is one of the major causes of dementia and its etiology is thought to be due to the aggregation of β-amyloid peptide (βA) which firstly generates oligomers and subsequently fibril deposits known as amyloid plaques. One of the most common factors of neurodegenerative diseases is aging due to the fact that they usually occur in old people. Several studies have in fact shown that endocannabinoids participate in the modulation of numerous cellular and molecular processes related to aging. In view of this, the main purposes of this Ph. D. Thesis were to: analyze endocannabinoid metabolism in the physiological and pathological aging process, and to study the modulation of this metabolism by cannabinoid receptor agonists and antagonists. These studies were carried out in rat cerebral cortex (CC) membrane and soluble fractions and synaptosomes, a brain area in which endocannabinoids exert their neuroprotective role. 2-AG and AEA hydrolysis and/or synthesis assays in synaptic endings and also in membranes from CC cells during aging showed a deregulation of their metabolism. As to 2-AG, it could be observed that its synthesis in rat CC was carried out by the enzymes lysophosphatidate phosphohydrolase (LPAase) and diacylglycerol lipase (DAGL). Furthermore, its hydrolysis in CC synaptic endings of adult and aged rats and in CC membranes of adult rats was exerted mainly by the enzyme monoacylglycerol lipase (MAGL). However, in CC membranes of aged rats the main enzyme involved was α/β serine hydrolase domain (ABHD). Deregulation of 2-AG metabolism in CC was observed to favor the decrease of these endocannabinoid levels, though compromising its neuroprotective role. As to AEA, these studies demonstrated that its hydrolysis either in CC synaptic endings or in CC membranes was carried out by the enzyme fatty acid amide hydrolase (FAAH). In addition, a different effect in AEA breakdown between cell membranes and synaptic endings was observed as a result of aging. In aged CC membranes, its hydrolysis was observed to increase. This could, in turn, compromise AEA antiinflamatory role in CC. On the other hand, AEA hydrolysis in synaptic endings during aging was observed to decrease, possibly protecting the brain against neurodegenerative damages inflicted by aging. Assays of CB1 and CB2 receptors levels in aged synaptic endings showed they were lower than in adults. Based on these results and on the disarrangement observed in endocannabinoid metabolism, regulation of endocannabinoid hydrolysis and/or synthesis by cannabinoid receptor agonists and antagonists were then assayed. These studies showed an increased 2-AG and AEA availability in CC synaptic endings of aged rats as a result of the presence of CB1 and CB2 receptor antagonists. On the other hand, cannabinoid receptor agonists, particularly through CB2, increased AEA availability either in synaptic endings or cell membranes from CC of aged rats. Endocannabinoid hydrolysis in early and late AD stages was assayed by preincubating CC synaptosomes with βA1-40 peptide in different conformations: oligomers (mimicking early AD stages) and fibrils (mimicking late AD stages). These studies showed that 2-AG and AEA hydrolysis in the early AD model diminished, thus indicating that both endocannabinoid levels could be increased and therefore protect the cell against neurodegenerative processes. Moreover, in the late AD model AEA hydrolysis decreased while 2-AG breakdown highly increased, thus compromising the neuroprotective role assigned to 2-AG. Summing up, results from this Ph. D. Thesis show a deregulation in endocannabinoid metabolism either in physiological or pathological aging, which could, in turn, lead to a failure of their neuroprotective functions, and a modulation of this metabolism as a result of aging, which could be exerted by CB1 and/or CB2 receptor agonists and/or antagonists.