Entre la limpieza y la integridad : un estudio de distintos métodos de preparación de material destinado a colecciones de historia natural

Abstract

Las colecciones de historia natural (CHN) forman parte del patrimonio de un país por ser fuente primaria de conocimiento y de información de la biodiversidad, tanto del pasado como del presente. Los métodos de preparación y conservación de los especímenes allí depositados juegan un rol preponderante en la calidad y cantidad de información que puede obtenerse a partir de ellos. En material esqueletario, las técnicas convencionales de limpieza pueden afectar no solo a las capas superficiales (grietas, delaminación, aumento de porosidad) sino también a la estructura interna, llegándose en los casos más severos a la deformación o desintegración, y a la pérdida de material genético. Los objetivos de esta tesis fueron, por un lado, evaluar los efectos de técnicas convencionales de preparación de material osteológico de mamíferos sobre sus características morfohistológicas, la cantidad y calidad del ADN y las propiedades biomecánicas; y por otro, evaluar la concentración y calidad del ADN en tejidos blandos y duros de mamíferos de distinta antigüedad, resguardados en diferentes colecciones científicas. Para el primer objetivo, se ensayaron varias técnicas convencionales de limpieza de huesos: enterramiento, exposición a escarabajos, y distintas combinaciones de temperatura-tiempo de exposición-concentración de agentes químicos y enzimáticos. Los huesos post-tratamiento fueron evaluados mediante microscopía electrónica de barrido (porcentaje de restos blandos, aspecto de la superficie ósea), histología de rutina, ensayos de flexión en tres puntos (análisis de propiedades biomecánicas) y técnicas moleculares (extracción de ADN para cuantificar concentración y pureza). Para el segundo objetivo se analizaron muestras de hueso y cuero de Puma concolor y Lycalopex gymnocercus, depositados en CHN de Argentina. La digestión química con KOH a baja concentración (5 %), corto tiempo de exposición (2 horas) y temperaturas de 40-70◦C, fue efectiva para eliminar tejidos blandos y mantener la integridad ósea. Sin embargo, combinaciones más agresivas provocaron daños importantes, incluyendo un aumento en porosidad y eventual desintegración del material. La digestión enzimática, menos eficaz en limpieza, permitió maximizar la concentración y pureza del ADN extraído, probablemente debido al efecto protector de los restos blandos sobre la superficie ósea. El tratamiento con escarabajos eliminó parcialmente el tejido blando, pero causó daños considerables en las superficies expuestas de los huesos. Los tratamientos de enterramiento fueron efectivos (0-3 % de restos), pero el deterioro óseo fue importante cuando el tiempo fue ≥ 30 días. Los protocolos empleados para procesar las muestras de las CHN fueron eficientes para obtener ADN de calidad para amplificar locus de microsatélites. El uso de cueros es una mejor alternativa si los especímenes de mamíferos carnívoros no superan los 30 años de antigüedad, ya que representan fuentes confiables y mínimamente destructivas de ADN endógeno. Para muestras más antiguas puede considerarse el uso de material óseo. Este trabajo proporciona una base para seleccionar protocolos que garanticen durabilidad y utilidad de muestras en las CHN, enfatizando la necesidad de considerar el compromiso entre limpieza e integridad. También brinda información sobre las características que deberían tenerse en cuenta al seleccionar muestras depositadas en dichas colecciones, para asegurase una mayor probabilidad de éxito en estudios con marcadores de microsatéites.

Natural History Collections (NHCs) are part of a country’s heritage, serving as a primary source of knowledge and information on biodiversity, both past and present. The preparation and preservation methods used for the specimens housed in these collections play a critical role in determining the quality and quantity of information that can be obtained from them. In skeletal material, conventional cleaning techniques can affect not only the surface layers (causing cracks, delamination, and increased porosity) but also the internal structure, leading, in severe cases, to deformation, disintegration, and the loss of genetic material. The objectives of this thesis were twofold: first, to evaluate the effects of conventional mammalian osteological preparation techniques on their morphohistological characteristics, DNA quantity and quality, and biomechanical properties; and second, to assess DNA concentration and quality in soft and hard tissues from mammals of different ages. For the first objective, several conventional bone-cleaning techniques were tested: burial, dermestid beetle exposure, and various combinations of temperature, exposure time, and concentrations of chemical and enzymatic agents. Post-treatment bones were evaluated using scanning electron microscopy (percentage of soft tissue remnants, bone surface appearance), routine histology, three-point bending tests (analysis of biomechanical properties), and molecular techniques (DNA extraction to quantify concentration and purity). For the second objective, bone and skin samples from Puma concolor and Lycalopex gymnocercus housed in Argentine NHCs were analyzed. Chemical digestion with low-concentration KOH (5 %), short exposure times (2 hours), and temperatures of 40-70◦C was effective in removing soft tissues while maintaining bone integrity. However, more aggressive combinations caused significant damage, including increased porosity and eventual material disintegration. Enzymatic digestion, while less effective for cleaning, maximized the concentration and purity of extracted DNA, likely due to the protective effect of residual soft tissues on the bone surface. Beetle treatment partially removed soft tissue but caused considerable damage to exposed bone surfaces. Burial treatments were effective (0-3 % soft tissue remnants), but significant bone deterioration occurred in treatments lasting ≥ 30 days. The protocols used to process NHC samples were efficient in obtaining DNA of sufficient quality to amplify microsatellite loci. The use of skins is a better alternative if carnivorous mammal specimens are less than 30 years old, as they represent reliable and minimally destructive sources of endogenous DNA. For older samples, the use of bone material may be considered. This work provides a basis for selecting protocols that ensure the durability and utility of NHC samples, emphasizing the need to balance cleaning efficacy and structural integrity. It also offers insights into the characteristics to consider when selecting samples from NHCs to ensure a higher likelihood of success in studies using microsatellite markers.