Diseño y estudios analíticos de microemulsiones portadoras de fármacos y biocidas

Abstract

El desarrollo de nuevos productos farmacéuticos y de cuidado personal que proporcionen múltiples acciones terapéuticas, más selectivas, duraderas o con menos efectos adversos para el organismo, es un desafío permanente en el campo de la investigación farmacéutica y cosmética. Sin embargo, existen problemas relacionados con la biodisponibilidad y estabilidad de distintas moléculas activas atribuibles principalmente al sistema portador o forma farmacéutica en la cual es vehiculizada, lo que promueve el diseño de nuevos sistemas portadores capaces de mejorar la efectividad terapéutica. En particular, es importante potenciar el desarrollo de formulaciones innovadoras, de bajo costo y mediante procedimientos sostenibles, que puedan llegar a distintos sectores de la sociedad y contribuyan a resolver problemáticas de salud pública como los efectos de la exposición solar excesiva y las infecciones ocasionadas por ciertos patógenos oportunistas, así como problemáticas que comprometen la producción y salud animal como ciertas enfermedades virales que afectan al ganado bovino. Por otro lado, el desarrollo de nuevas formulaciones involucra la implementación de procedimientos analíticos para la evaluación de su eficacia y estabilidad. En este contexto, es necesario el desarrollo de nuevas metodologías analíticas sostenibles que reemplacen parcial o totalmente los métodos actuales de análisis, los cuales suelen involucrar el uso de técnicas costosas y poco amigables con el ambiente. Las microemulsiones son sistemas dispersos y organizados constituidos por una fase oleosa, una fase acuosa y una mezcla de surfactante:co-surfactante, las cuales son transparentes, ópticamente isotrópicas y termodinámicamente estables. La existencia de microdominios de diferente polaridad posibilita solubilizar compuestos tanto hidrofílicos como lipofílicos, incluso si resulta de interés en simultáneo en la misma formulación. Las microemulsiones se han utilizado para cargar fármacos y biocidas con el objetivo de mejorar su biodisponibilidad y estabilidad. Estos sistemas presentan la capacidad de proteger compuestos lábiles y permitir la liberación del activo cargado de forma sostenida y controlada. Además, la obtención de estos sistemas es simple, rápida y requiere de procedimientos de baja energía lo que contribuye a la sustentabilidad. Por otro lado, la vía de administración de un fármaco supone un factor determinante en las propiedades farmacocinéticas del mismo, condicionando en última instancia su eficacia y efecto biológico. El desarrollo de nuevos sistemas portadores tiene como objetivo mejorar las propiedades farmacocinéticas del fármaco de manera que disminuya al máximo los efectos adversos dependientes de la vía de administración y su distribución posterior en el organismo. En particular, la vía de administración tópica permite aplicar el fármaco en el lugar de acción de tal manera que el efecto es local, evitando la absorción sistémica del mismo. Esta vía se utiliza para el tratamiento local de afecciones de la piel evitando el primer paso hepático y las fluctuaciones de las concentraciones plasmáticas. Además, permite una absorción adecuada del fármaco, reduce la variabilidad interindividual en la absorción, prolonga la duración de la acción y mejora el cumplimiento terapéutico. Además, es la vía utilizada para la aplicación de diferentes productos de cuidado personal tales como protectores solares. En la primera parte del presente trabajo de Tesis, se diseñó una nueva formulación del tipo microemulsión aceite en agua (o/w) como portador del filtro químico solar benzofenona-3 (BZ3), a partir de materiales biocompatibles y de uso común en la producción de productos de uso cosmético como miristato de isopropilo (fase oleosa), Tween 80: etanol (surfactante:co-surfactante) y agua (fase acuosa). Mediante la construcción de diagramas de fases pseudoternarios se obtuvieron distintas microemulsiones las cuales se caracterizaron fisicoquímicamente. En base a estos resultados se seleccionó un sistema óptimo para la carga de BZ3 al 2,0% (p/p). La formulación obtenida (BZ3-ME) estuvo compuesta por 2,5% (p/p) de miristato de isopropilo, 42,0% (p/p) de una mezcla Tween 80: etanol (2:1) y 55,5% (p/p) de agua. La misma presentó una distribución de tamaño uniforme (PdI = 0,224 ± 0,017) y un tamaño de gota en el rango nanométrico (Z = 11,90 ± 0,93 nm). El pH obtenido (5,50 ± 0,03) resultó apropiado para la aplicación tópica y los resultados de índice de refracción (1,3350 ± 0,0002) y conductividad eléctrica (0,065 ± 0,010) mS corroboraron que se trató de un sistema isotrópico y de tipo aceite en agua (o/w), respectivamente. Entonces, se realizaron estudios analíticos de degradación térmica de BZ3 a 60ºC para evaluar el comportamiento del filtro cuando se encontraba cargado en la microemulsión (BZ3-ME) respecto a cuando se encontraba en un medio no-organizado (BZ3-NO). La detección se realizó mediante espectrometría de fluorescencia molecular lo que permitió monitorear en tiempo real dicho proceso y obtener los correspondientes perfiles de degradación térmica. El perfil de BZ3-NO presentó una disminución en la concentración de BZ3 a lo largo del tiempo de análisis, arrojando una constante cinética de termodegradación Kt de (0,069 ± 0,001) min- 1 mientras que el perfil de BZ3-ME se mantuvo sin cambios bajo las condiciones de estudio. Esto indicó que el sistema portador protegió de cierta manera al filtro químico solar de la degradación inducida por la temperatura, en las condiciones estudiadas. Por otra parte, se abordó un estudio de permeación in-vitro de BZ3-ME utilizando la tradicional celda de difusión de Franz, y mediante detección por espectrometría de absorción molecular UV-Vis. El proceso de permeación de BZ3 se registró durante 60 min utilizando una membrana sintética de acetato de celulosa. La concentración acumulada de BZ3 por unidad de área se relacionó linealmente con el tiempo de permeación, y a partir del perfil de permeación de BZ3 se calculó la correspondiente constante de permeación Kp la cual fue de (3,06 x 10-3 ± 4,0 x 10-7) cm h-1 sugiriendo que BZ3 presentó un perfil de permeación adecuado en el sistema portador propuesto y comparable con el filtro cargado en otros sistemas portadores reportados en la literatura. Finalmente, se determinó la eficacia de BZ3-ME mediante la determinación del factor de protección solar in-vitro (FPSin-vitro) el cual fue 2,0, un valor esperable dada la concentración de filtro químico utilizado y a que fue el único filtro cargado en la microemulsión. En un segundo trabajo, se utilizó la microemulsión previamente obtenida como sistema portador de ciprofloxacina (CIP), el cual es un antibiótico de amplio espectro utilizado para el tratamiento de infecciones causadas por el patógeno oportunista Staphylococcus aureus. En este caso, se logró cargar de manera exitosa la microemulsión con una concentración final de CIP de 0,3% (p/p) la cual estuvo dentro del rango terapéutico. La formulación (CIP-ME) se caracterizó fisicoquímicamente y los resultados mostraron que se trató de un sistema monodisperso (PdI = 0,259 ± 0,021) y con un tamaño de gota nanométrico (Z = 13,44 ± 0,24 nm), lo que en este caso fue corroborado a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Además, la formulación presentó un valor de pH de 5,32 ± 0,01 el cual resultó óptimo para uso tópico e intranasal y una osmolaridad de 341,9 mOsm L-1 la cual resultó adecuada para la instilación. Por otro lado, se estudió mediante espectrometría de fluorescencia molecular la distribución de CIP en la microemulsión (o/w), dada la moderada solubilidad del antibiótico en agua, concluyendo que éste se ubicó preferentemente en la interfase fase oleosa-fase acuosa, e interaccionando probablemente con el surfactante. A su vez, se abordó un estudio de permeación in-vitro para el cual se diseñó un sistema automático en línea, de fácil implementación, bajo costo y utilizando electrónica Arduino, el cual empleó la tradicional celda de difusión de Franz y permitió monitorear en tiempo real mediante espectroscopía de fluorescencia molecular el proceso de permeación de CIP a través de una membrana sintética que simuló la piel. A partir del análisis espectral se obtuvieron los perfiles de permeación de CIP en la microemulsión (CIP-ME) y en un medio no-organizado (CIP- NO) que permitieron calcular las correspondientes constantes de permeación (Kp). Los resultados obtenidos de la cinética de permeación de CIP en CIP-ME (Kp = 2,76 × 10−4 ± 9,00 × 10−6) respecto a CIP-NO (5,30 × 10−5 ± 5,0 × 10−7) mostraron que la difusión a través de la membrana de CIP en CIP-NO fue significativamente menor en contraste con CIP-ME. Por último, se realizaron estudios biológicos in-vitro e in-vivo de la actividad antimicrobiana utilizando un modelo murino de infección cutánea y otro de infección intranasal para comprobar la efectividad de la formulación propuesta, y de esta manera obtener la eficacia terapéutica en el sitio de la infección. Entonces, se evaluaron los efectos de CIP-ME sobre la piel de ratones infectados por S. aureus. Luego de 24 h de la infección se observó una reducción visible de las lesiones y del eritema en el área afectada cuando los ratones fueron tratados con CIP-ME respecto a los ratones del grupo control, que presentaron lesiones ulceradas y eritematosas con escaso exudado. Además, el número de bacterias viables recuperadas de la piel de los ratones tratados con CIP-ME fue significativamente menor que el de los grupos control, lo que demostró que el tratamiento con CIP-ME provocó una reducción significativa de la infección en piel por S. aureus en ratones. En el caso de los estudios de colonización intranasal, el número de bacterias viables recuperadas de la nariz de ratones tratados con la formulación propuesta resultó 1,2 × 103 UFC mL−1, un valor que fue significativamente menor que los correspondientes a la microemulsión sin carga, el cual fue 2,8 × 104 UFC mL−1, y que el grupo control, el cual presentó 4,7 × 104 UFC mL−1. Esto demostró que el tratamiento con CIP-ME provocó una reducción significativa de la colonización nasal de S. aureus en ratones. Finalmente, en la última parte de la Tesis se planteó el diseño y obtención de un nuevo sistema del tipo microemulsión (o/w) basada en activos naturales con capacidad antioxidante y antiviral frente a betacoronavirus bovino (BCoV) y alfaherpesvirus bovino 1 (BoHV-1) para uso tópico. Para ello, se utilizó como fase oleosa aceite esencial de albahaca (AEA), el cual presenta comprobadas propiedades antivirales, una mezcla de Cremophor EL: etanol (CR:ET) como surfactante:co-surfactante y agua como fase acuosa. Se realizaron diagramas de fases pseudoternarios y los sistemas seleccionados se caracterizaron fisicoquímicamente y fueron sometidos a estudios de estabilidad acelerada que involucraron un test de centrifugación y ciclos de frío-calor. Luego se seleccionó el sistema óptimo, el cual estuvo compuesto por 5,0% de AEA, 30,0% de CR:ET (2:1) y 65,0% de agua. El mismo se cargó posteriormente con el antioxidante natural quercetina (QE) a una concentración final de 100 mg L-1. La microemulsión cargada con quercetina (QE-ME) presentó un tamaño de gota nanométrico de (17,47 ± 0,33) nm y un PdI de 0,049 ± 0,027. El valor de pH obtenido 4,69 ± 0,10 resultó adecuado para uso tópico. Con respecto a los valores de índice de refracción (1,3378 ± 0,0013) y conductividad eléctrica (0,101 ± 0,010) mS cm-1, éstos corroboraron que QE-ME resultó ser un sistema isotrópico y de tipo (o/w), respectivamente. En este caso, el estudio de permeación se realizó mediante un nuevo método analítico miniaturizado denominado mini-Franz, que reemplazó a la tradicional celda de difusión de Franz por una celda estándar de cuarzo con un dispositivo portamembrana/portamuestra desarrollado con tecnología 3D, y un sistema de agitación magnética que se acopló directamente al portacelda de un espectrofotómetro UV-Vis. Esto permitió obtener los datos del proceso de permeación de QE-ME en tiempo real, reduciendo volumen de muestra y solución aceptora, y minimizando la generación de residuos. El valor de Kp obtenido (5,96 × 10−3 ± 5,0 × 10−7) cm h−1 resultó adecuado para su aplicación tópica. Además, se validó el nuevo método propuesto frente al método de difusión de Franz tradicional demostrando que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ambas metodologías. Por otro lado, se evaluó la eficacia antiviral de la formulación a través de diferentes ensayos in-vitro. Por un lado, se evaluó la citotoxicidad de la microemulsión sin carga (ME) y cargada con quercetina (QE-ME) en líneas celulares de adenocarcinoma rectal (HRT-18) y de riñón bovino (MDBK) para BCoV y BoHV-1, respectivamente. Luego, se realizó un ensayo de pre-tratamiento en el cual las monocapas celulares se expusieron a las microemulsiones y posteriormente fueron inoculadas con los virus en estudio. Por último, se evaluó la capacidad de las microemulsiones de adsorber los viriones de BCoV y BoHV-1 a través del ensayo de adsorción viral (binding). Con respecto al ensayo de pre- tratamiento, en ambos casos se observó una reducción significativa en los títulos virales en todos los grupos pre-tratados con microemulsiones, cargadas con quercetina como sin cargar, en comparación con el control positivo, es decir, monocapas celulares infectadas sin exposición previa a las microemulsiones. De la misma manera, el ensayo de binding para ambos virus demostró que las formulaciones evaluadas (ME y QE-ME) lograron reducir significativamente los títulos virales en comparación con el control no tratado con microemulsiones. Sin embargo, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los títulos virales de BCoV y BoHV-1 obtenidos tras el tratamiento con las distintas microemulsiones, es decir, ME y QE-ME. Estos resultados mostraron que, bajo las condiciones ensayadas, la presencia de QE no mejoró la actividad antiviral de las microemulsiones en la concentración estudiada. Por último, se determinó la capacidad antioxidante de ME y QE-ME mediante el método DPPH (2,2-difenil-1- picrilhidrazilo). La microemulsión sin carga no presentó una tendencia definida en su actividad antioxidante con el aumento de la concentración, alcanzando un porcentaje máximo de inhibición cercano al 30%, dentro del rango de concentraciones evaluado. Por el contrario, QE-ME demostró una tendencia creciente en su capacidad de eliminación del radical DPPH, con valores de inhibición que aumentaron progresivamente hasta alcanzar un máximo de inhibición cercano al 92% con la concentración más alta estudiada (40 g L-1). Este resultado fue comparable al obtenido con el control positivo (ácido ascórbico), con el que se consiguió un 93% de inhibición. Esto demostró que QE-ME presentó una significativa capacidad antioxidante.

The development of new pharmaceutical and personal care products that offer multiple therapeutic actions -greater selectivity, prolonged efficacy, or reduced adverse effects on the body- remains a constant challenge in the fields of pharmaceutical and cosmetic research. However, issues related to the bioavailability and stability of various active molecules often arise, primarily due to limitations inherent to the delivery system or pharmaceutical form in which these molecules are incorporated. This underscores the need for designing novel carrier systems capable of enhancing therapeutic efficacy. In particular, there is a pressing need to foster the development of innovative, cost-effective formulations obtained through sustainable processes, which can be made accessible to various sectors of society and help address public health challenges. These include adverse effects associated with excessive solar exposure and infections caused by opportunistic pathogens, as well as issues impacting animal health and production, such as certain viral diseases affecting bovine livestock. Furthermore, the development of new formulations requires the implementation of analytical procedures for assessing their efficacy and stability. In this context, it becomes imperative to develop novel, environmentally sustainable analytical methodologies that can partially or entirely replace conventional analytical techniques, which often involve expensive and environmentally hazardous procedures. Microemulsions are organized, dispersed systems composed of an oil phase, an aqueous phase, and a surfactant:co-surfactant mixture. They are transparent, optically isotropic, and thermodynamically stable. The presence of microdomains with varying polarity allows for the simultaneous solubilization of both hydrophilic and lipophilic compounds within a single formulation. Microemulsions have been employed as delivery systems for drugs and biocides to enhance their bioavailability and stability. These systems are capable of protecting labile compounds and enabling sustained and controlled release of the encapsulated active agent. Additionally, their preparation is simple, rapid, and requires low-energy processes, thereby contributing to overall sustainability. Moreover, the route of drug administration is a critical factor influencing its pharmacokinetic properties, ultimately determining its efficacy and biological effect. The development of novel carrier systems aims to optimize the pharmacokinetic profile of the drug to minimize route-dependent adverse effects and improve its subsequent distribution within the body. Specifically, topical administration allows for localized drug application at the site of action, thereby avoiding systemic absorption. This route is employed for the local treatment of skin conditions, circumventing hepatic first-pass metabolism and reducing fluctuations in plasma concentrations. It also ensures adequate drug absorption, decreases interindividual variability in uptake, prolongs the duration of action, and enhances patient compliance. Moreover, it is the route commonly used for applying various personal care products, such as sunscreens. In the first part of this Thesis, a novel oil-in-water (o/w) microemulsion formulation was developed as a carrier for the chemical sunscreen agent benzophenone- 3 (BZ3), using biocompatible materials commonly used in cosmetic product manufacturing. The components included isopropyl myristate (oil phase), Tween 80:ethanol (2:1) as the surfactant:co-surfactant mixture, and water (aqueous phase). Pseudoternary phase diagrams were constructed to identify various microemulsion systems, which were subsequently characterized through physicochemical methods. Based on these results, an optimal formulation was selected for the incorporation of BZ3 at 2.0% (w/w). The resulting formulation (BZ3-ME) consisted of 2.5% (w/w) isopropyl myristate, 42.0% (w/w) of the Tween 80:ethanol mixture (2:1), and 55.5% (w/w) water. This system exhibited a uniform size distribution (PdI = 0.224 ± 0.017) and nanometric droplet size (Z = 11.90 ± 0.93 nm). The measured pH (5.50 ± 0.03) was appropriate for topical application, while the refractive index (1.3350 ± 0.0002) and electrical conductivity (0.065 ± 0.010 mS) confirmed the isotropic nature and (o/w) type of the system, respectively. Subsequently, analytical studies were conducted to evaluate the thermal degradation of BZ3 at 60°C, comparing its behavior when loaded in the microemulsion (BZ3-ME) versus a non-organized medium (BZ3-NO). Detection was carried out using molecular fluorescence spectrometry, enabling real-time monitoring and the generation of corresponding thermal degradation profiles. The BZ3-NO profile showed a progressive decrease in BZ3 concentration over the analysis period, yielding a thermal degradation rate constant Kt of (0.069 ± 0.001) min-1. In contrast, the BZ3-ME profile remained unchanged under the same conditions, indicating that the microemulsion system conferred a degree of protection against temperature-induced degradation of the chemical sunscreen agent. Additionally, an in-vitro permeation study of BZ3-ME was performed using the conventional Franz diffusion cell and UV-Vis molecular absorption spectrometry for detection. The permeation of BZ3 was monitored over 60 min using a synthetic cellulose acetate membrane. The cumulative concentration of BZ3 per unit area displayed a linear relationship with time, and the corresponding permeation constant Kp was calculated as (3.06 x 10-3 ± 4.0 x 10-7) cm h-1. This suggests that BZ3 exhibited an appropriate permeation profile in the proposed delivery system, comparable to values reported for the same active ingredient incorporated into other carrier systems in the literature. Finally, the efficacy of BZ3-ME was evaluated by determining its in-vitro sun protection factor (SPFin-vitro), which was found to be 2.0. This value was expected given the concentration of the active agent and the fact that it was the only UV filter incorporated into the microemulsion. In a second study, the previously developed microemulsion was employed as a carrier system for ciprofloxacin (CIP), a broad-spectrum antibiotic used to treat infections caused by the opportunistic pathogen Staphylococcus aureus. In this case, the microemulsion was successfully loaded with a final CIP concentration of 0.3% (w/w), which falls within the therapeutic range. The formulation (CIP-ME) was physicochemically characterized, and the results indicated that it was a monodisperse system (PdI = 0.259 ± 0.021) with nanometric droplet size (Z = 13.44 ± 0.24 nm), corroborated via transmission electron microscopy (TEM). Furthermore, the formulation exhibited a pH value of 5.32 ± 0.01, suitable for both topical and intranasal applications, and an osmolarity of 341.9 mOsm L⁻¹, appropriate for instillation. The distribution of CIP within the oil-in-water microemulsion was investigated using molecular fluorescence spectrometry, given the moderate solubility of the antibiotic in water. It was concluded that CIP localized preferentially at the oil-water interface, likely interacting with the surfactant component. Additionally, an in-vitro permeation study was conducted using a custom-designed, low-cost, real-time monitoring system based on Arduino electronics. This setup incorporated a standard Franz diffusion cell and allowed continuous monitoring of the CIP permeation process through a synthetic membrane simulating skin, using fluorescence spectroscopy. Spectral analysis enabled the acquisition of permeation profiles for CIP both within the microemulsion (CIP-ME) and in a non-organized medium (CIP-NO), from which the corresponding permeation constants Kp were calculated. The results revealed that the permeation kinetics of CIP in CIP-ME (Kp = 2.76 × 10-4 ± 9.00 × 10-6 cm·h-1) were significantly greater than in CIP-NO (Kp = 5.30 × 10-5 ± 5.00 × 10-7 cm·h⁻¹), indicating that diffusion of CIP across the membrane was markedly enhanced in the microemulsion system. Finally, in-vitro and in-vivo biological studies were carried out to assess the antimicrobial activity of the proposed formulation using murine models of cutaneous and intranasal infection, in order to determine its therapeutic efficacy at the site of infection. The effects of CIP-ME on the skin of mice infected with S. aureus were evaluated. After 24 h post-infection, a visible reduction in lesion size and erythema was observed in the affected area of mice treated with CIP-ME, compared to control group mice, which exhibited ulcerated and erythematous lesions with minimal exudate. Additionally, the number of viable bacteria recovered from the skin of CIP-ME–treated mice was significantly lower than in the control groups, demonstrating that treatment with CIP-ME significantly reduced S. aureus skin infection in the murine model. In the case of intranasal colonization studies, the number of viable bacteria recovered from the nasal cavity of mice treated with the proposed formulation was 1.2 × 10³ CFU·mL⁻¹, a value significantly lower than that observed for the unloaded microemulsion (2.8 × 10⁴ CFU·mL⁻¹) and the control group (4.7 × 10⁴ CFU·mL⁻¹). These results confirmed that treatment with CIP-ME significantly reduced S. aureus nasal colonization in mice. Finally, in the last part of this Thesis, the design and development of a new oil-in- water (o/w) microemulsion system based on natural active ingredients with antioxidant and antiviral properties against bovine betacoronavirus (BCoV) and bovine alphaherpesvirus 1 (BoHV-1) for topical use was proposed. Essential basil oil (EBO), known for its proven antiviral properties, was employed as the oil phase, while a mixture of Cremophor EL:ethanol (CR:ET) served as the surfactant:co-surfactant mixture, and water was used as the aqueous phase. Pseudoternary phase diagrams were constructed, and the selected systems were characterized physicochemically and subjected to accelerated stability tests, including centrifugation and thermal cycling. Based on these results, the optimal formulation was selected, consisting of 5.0% EBO, 30.0% CR:ET (2:1), and 65.0% water. This system was then loaded with the natural antioxidant quercetin (QE) at a final concentration of 100 mg L⁻¹. The resulting quercetin-loaded microemulsion (QE-ME) exhibited a nanoscale droplet size (17.47 ± 0.33 nm) and a low polydispersity index (PdI = 0.049 ± 0.027). The measured pH value (4.69 ± 0.10) was suitable for topical application. Additionally, the refractive index (1.3378 ± 0.0013) and electrical conductivity (0.101 ± 0.010 mS cm⁻¹) confirmed that QE-ME was an isotropic and oil-in-water type system. In this case, permeation was evaluated using a novel miniaturized analytical method termed mini-Franz, which replaced the traditional Franz diffusion cell with a standard quartz cuvette fitted with a 3D-printed membrane/sample holder and a magnetic stirring system coupled directly to a UV-Vis spectrophotometer cell holder. This setup enabled real-time monitoring of the QE-ME permeation process, reducing sample and acceptor solution volumes, and minimizing waste generation. The obtained permeation coefficient (Kp = 5.96 × 10⁻³ ± 5.0 × 10⁻⁷ cm h⁻¹) was adequate for topical application. Furthermore, the proposed method was validated against the traditional Franz cell method, with no statistically significant differences observed between the two methodologies. The antiviral efficacy of the formulation was subsequently evaluated through various in-vitro assays. First, cytotoxicity of both the unloaded microemulsion (ME) and QE-loaded microemulsion (QE-ME) was assessed in rectal adenocarcinoma (HRT-18) and bovine kidney (MDBK) cell lines for BCoV and BoHV-1, respectively. A pre-treatment assay was then performed, where cell monolayers were exposed to the microemulsions prior to viral inoculation. Finally, a viral adsorption (binding) assay was conducted to assess the ability of the microemulsions to bind BCoV and BoHV-1 virions. In the pre-treatment assay, both ME and QE-ME significantly reduced viral titers in comparison with the positive control (i.e., infected monolayers not pre-exposed to microemulsions). Similarly, the binding assay revealed that both formulations significantly decreased viral titers compared to the untreated control. However, no statistically significant differences were found between ME and QE-ME, indicating that the presence of QE did not enhance the antiviral activity of the microemulsions at the tested concentration. Lastly, the antioxidant capacity of ME and QE-ME was evaluated using the DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) method. The unloaded microemulsion (ME) exhibited no defined trend in antioxidant activity with increasing concentration, with a maximum inhibition of approximately 30% within the tested concentration range. In contrast, QE-ME showed a clear dose-dependent antioxidant effect, achieving a maximum inhibition of 92% at the highest concentration tested (40 g L⁻¹), comparable to that of the positive control (ascorbic acid), which reached 93%. These results demonstrated that QE-ME possesses significant antioxidant activity.