Proteínas del ciclo del hierro y su integración regulatoria

Abstract

El objetivo de este trabajo de tesis fue estudiar la coordinación regulatoria de proteínas que participan en la movilización y depósito de hierro a través de las membranas celulares, en condiciones experimentales de balance y desbalance del ciclo del biometal. Los objetivos planteados se analizaron con un concepto fisiológico y fisiopatológico integrativo en un Modelo in vivo de ratón, desarrollando un Modelo Animal de Sobrecarga de Hierro, combinándolo con eritropoyesis activa inducida por eritropoyetina, y en un Modelo in vitro de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y de Sobrecarga de Hierro con citrato amónico férrico (FAC) o peróxido de hidrógeno (H2O2), previamente tratadas con eritropoyetina o N acetyl cisteina (NAC). Los modelos de Sobrecarga de Hierro con las estrategias experimentales diseñadas nos posibilitaron estudiar la respuesta de las proteínas del Ciclo de Hierro frente a los cambios inducidos, evaluando la expresión de las siguientes proteínas: importador de metales divalentes 1 (DMT1); importador ZIP14 (SLC39A14); receptor de Transferrina 1 (RTf1); receptor de Transferrina 2 (RTf2); proteínas regulatorias como la proteína de la hemocromatosis (HFE) y Prohepcidina; proteínas de depósito de hierro como L y H Ferritina; Hemosiderina. Para la identificación de proteínas y la evaluación de su expresión y localización se utilizaron métodos inmunohistoquímicos, inmunocitoquímicos y de inmunofluorescencia. La optimización del Modelo Animal de Sobrecarga de Hierro con inducción de eritropoyesis activa se evaluó mediante la determinación de parámetros hematológicos y estudios morfológicos del bazo como el principal órgano eritropoyético extramedular murino en el ratón adulto. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro en el bazo se observó un significativo aumento de la expresión citoplasmática de proteínas responsables de la captación de hierro celular (DMT1 y ZIP14) y de las proteínas de depósito Ferritina y Hemosiderina y de la proteína reguladora Prohepcidina. Estos cambios ponen en evidencia la inducción de un mecanismo inhibitorio de liberación del hierro celular, que estaría mediado por el eje hepcidina-ferroportina. En estas condiciones experimentales, el exceso de hierro induce el aumento en la expresión de Prohepcidina que, como principal hormona regulatoria, degrada la Ferroportina, única proteína que induce la liberación del hierro celular vía proteosomal previa ubiquitinización, originando, como consecuencia, la retención celular de hierro. Por el contario, en el modelo de Sobrecarga de Hierro combinado con eritropoyesis activada por EPO se redujo la expresión de estas proteínas sugiriendo que la activación de la eritropoyesis induce

la liberación de hierro, lo que indicaría que EPO es la señal predominante, sobre la señal de hierro, que preponderó en el modelo combinado. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro duodenal la marcada localización perinuclear de DMT1 y la disminución de la expresión citoplasmática de ZIP14, inducen la reducción de la absorción de hierro dietario, como un mecanismo protector para limitar la captación del biometal ya que el mismo se encuentra en exceso, en este sentido DMT1 sigue la señal de EPO y ZIP14 sigue la señal de hierro. En el tejido duodenal la administración de EPO reveló la evidente localización apical de DMT1 y la marcada expresión citoplasmática de ZIP14, que indicarían que la eritropoyesis activó la captación del hierro de la dieta para cubrir las necesidades de la síntesis de eritrocitos. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro en hígado se observó un evidente aumento de la expresión citoplasmática de ZIP14, responsable de la captación de hierro celular y de la expresión de las proteínas de depósito, L ferritina y hemosiderina, y de prohepcidina indicando aumento de la captación celular de hierro, de los depósitos del mismo y la inhibición de la liberación del hierro celular por el eje hepcidina-ferroportina en estas condiciones experimentales. Por el mecanismo descripto se le puede adjudicar al hígado la función de órgano de depósito de hierro. El hígado desarrollaría un efecto regulador o protector de la captación del hierro en exceso que se deduce de la disminución de la expresión de DMT1 que podría ser mediada por hepcidina, inhibiendo así la captación de hierro en exceso. En el Modelo de Eritropoyesis la presencia de eritropoyetina depleciona los depósitos hepáticos de hierro para utilizarlo en la eritropoyesis activa estimulando la liberación del biometal desde los hepatocitos via el eje hepcidina-FPN. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro la corteza renal mostró aumento de su captación y elevados depósitos en forma de L ferritina y Hemosiderina mediados por el importador ZIP14. Asimismo, se observó aumento de la expresión de prohepcidina. Al igual que en hígado la disminución de la expresión de DMT1 que podría ser regulada por hepcidina no logró contrarrestar el exceso de la captación de hierro por el aumento de la expresión de ZIP14. Entre los órganos particularmente susceptibles al exceso de hierro se pueden mencionar, corazón, pulmón y páncreas. Nuestros estudios muestran que el importador ZIP14 cardíaco no tuvo cambios de expresión y localización por el efecto de hierro y EPO mientras que DMT1 disminuyó su expresión como en otros tejidos frente al estímulo del exceso del biometal. Podemos concluir que en corazón el exceso de hierro no estaría mediado por los importadores ZIP14 y DMT1. Asimismo, en el Modelo de Eritropoyesis activa, la eritropoyetina tendría un rol

protector en corazón disminuyendo los niveles de los depósitos de hierro independientemente de DMT1 y ZIP14 aumentando la liberación de hierro. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro en pulmón, el aumento en la captación celular de hierro estaría mediado por la localización apical de DMT1 y el aumento de la expresión citoplasmática de ZIP14. En presencia de EPO se observó redistribución de DMT1 al citoplasma celular y disminución de la expresión de ZIP14, disminuyendo la captación de hierro cuando coexisten sobrecarga y EPO. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro en el páncreas endócrino se observó la disminución de la expresión de DMT1 y del Receptor de Transferrina 1 (Rtf1) lo que indicaría la existencia de un mecanismo protector en islotes de Langerhans para disminuir la captación de hierro en exceso. Mientras que en páncreas exócrino los acinos incorporan el hierro vía el aumento de la expresión de ZIP14 depositando el hierro en exceso en las proteínas de depósito L-ferritina y hemosiderina. En presencia de EPO en islotes de Langerhans se podría estimular la captación celular de hierro mediada por el evidente aumento de la expresión de DMT1. En presencia de EPO en acinos pancreáticos la marcada disminución de la expresión de ZIP14 podría explicar la disminución de la captación de hierro. Podemos concluir que, en presencia de hierro y EPO, el páncreas endócrino es regulado por el mecanismo que responde a la señal hierro mientras que el páncreas exócrino es regulado por la señal EPO y de esta forma disminuye los depósitos de hierro ante la gran demanda de la eritropoyesis activa. En los estudios del Modelo de Sobrecarga de Hierro en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y realizados en ausencia de NAC, se vio que el exceso de hierro induce la muerte neuronal mediada por especies reactivas de oxígeno (ROS) mientras que en presencia de NAC se revierte el efecto sobre la viabilidad celular inducido por FAC y la expresión de las proteínas clave del ciclo de hierro. En exceso de hierro si bien se observó la disminución de la expresión de DMT1 que podría ser mediada por hepcidina, el cambio observado no logró proteger a las células neuronales del exceso debido a la incorporación del biometal mediada por el aumento de la expresión de ZIP14 y la endocitosis de RTf1. Una hipótesis posible que explicaría el exceso de hierro neuronal es el aumento de la expresión de prohepcidina en Sobrecarga de Hierro que inhibe su liberación celular mediante el eje hepcidina-FPN. Un hallazgo a destacar de nuestros estudios fue demostrar por primera vez por inmunofluorescencia la vía de señalización neuronal que induce el aumento de la síntesis de hepcidina mediada por la colocalización de HFE y RTf2.

En presencia de eritropoyetina se observó un aumento significativo de la viabilidad celular, sin embargo, ese mecanismo no sería mediado por las proteínas clave del ciclo del hierro, pero podría involucrar otras vías de señalización como las proteínas antiapoptóticas. Los estudios en sistema nervioso permitieron demostrar que este tejido posee los mecanismos necesarios para almacenar hierro en exceso. Los estudios realizados en las regiones como estriado, hipocampo, sustancia negra y cerebelo mostraron la disminución de la expresión de DMT1 y el aumento de la expresión de ZIP14 en concordancia con lo observado en la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Sin embargo, serán necesarios futuros estudios para comprender la homeostasis del hierro y su regulación en el sistema nervioso. Finalmente, la relación entre el hierro y las proteínas que regulan el ciclo del hierro en las células de los modelos estudiados contribuirán a la mejor comprensión de los mecanismos que participan en la fisiología y fisiopatología del ciclo del hierro. La acción protectora de EPO en células neuronales y en los diferentes tejidos estudiados abre un futuro prometedor para adjudicarle a esta hormona un posible rol en el tratamiento de enfermedades asociadas con desordenes de exceso de hierro.

The aim of this work was to study the regulatory coordination of the proteins involved in mobilization and deposition of iron across the cell membranes, in balance and imbalance of the biometal cycle states. The proposed objectives were analysed with physiological and physio pathological integrative concept in an in vivo mouse model developing an Animal Model of Iron Overload, combined with active erythropoiesis induced by erythropoietin (EPO) and in an in vitro model of human neuroblastoma cells SH-SY5Y of Iron Overload with ferric ammonium citrate (FAC) or hydrogen peroxide (H2O2), previously treated with N acetyl cysteine (NAC) or EPO. The Iron Overload models with the experimental strategies designed allow us to study the response to Iron cycle to the induced changes, evaluating the expression of the following proteins: divalent metals transporter 1 (DMT1), importer ZIP14 (SLC39A14), Transferrin Receptor 1 (TRf1), Transferrin Receptor 2 (TRf2), regulatory proteins that the hemochromatosis protein (HFE) and prohepcidin, deposit proteins that L and H Ferritin and Hemosiderin. Immunohystochemistry, immucytochemistry and immunofluoresce were used in the identification of proteins and in the evaluation of their expression and location. The efficiency of the animal model of Iron Overload with induction of active erythropoiesis was evaluated by determining haematological parameters and morphological studies of the spleen as the main murine extramedullary erythropoietic organ in the adult mouse. In the Iron Overload model in the spleen, we observed a significative increase in the cytoplasmic expression of importer proteins DMT1 and ZIP14, and in the deposit proteins Ferritin and Hemosiderin and in the regulatory protein Prohepcidin. These changes reflect the induction of the inhibitory iron cellular depletion mechanism mediated by the hepcidin-ferroportin axis. In these experimental conditions, the Iron Overload induce the increased Prohepcidin expression that degrade the unique Iron exporter Ferroportin by proteosome previous ubiquitination consequently the Iron is retained in the cell. In the opposite side, in the Iron Overload combined with active erythropoiesis by EPO the protein expression was lower than the Iron Overload condition suggesting that the erythropoiesis induce iron release indicating that EPO is the predominant signal.

In the duodenal Iron Overload model, the marked DMT1 perinuclear location and the decrease in cytoplasmic ZIP14 expression induce the reduction of the dietary iron absorption, as a protective mechanism to limit the biometal uptake since it is in excess. When erythropoiesis by EPO was activated in duodenal tissue the DMT1 apical location was evident and the marked cytoplasmatic ZIP14 expression was observed, suggesting that the erythropoiesis activated the iron dietary uptake to cover the needs in the erythrocytes synthesis. In the liver of Iron Overload model we observed an evidente increase in the cytoplasmatic ZIP14 expression, the protein responsable for the iron uptake and the increase in the deposit proteins L ferritin and hemosiderin expression and the increase in the expression of the regulatory protein prohepcidin, suggesting the increment in the iron uptake, store and the release inhibition by the hepcidin-ferroportin axis in these experimental conditions. By the describe mechanism, the liver can be assigned the function of iron deposition organ. The liver would develop a regulatory or protective effect of iron excess uptake that is deduce from the lower DMT1 expression that could by mediated by hepcidin, thus inhibiting iron excess uptake. In the Erythropoiesis model the EPO presence deplets the hepatic iron store for use in the active erythropoiesis by stimulating the hepatocyte biometal release by the hepcidin-ferroportin axis. In the Iron Overload model the renal cortex showed a significative increase in iron uptake and deposits as L-ferritin and hemosiderin mediated by the ZIP14 iron importer. Increased expression of prohepcidin was also observed. As in the liver, the decreased DMT1 expression that could be regulated by hepcidin failed to counteract the iron excess uptake mediated by the increase in the ZIP14 expression. The heart, lung and pancreas are organs particularly susceptible to iron excess. We demostrate that cardiac ZIP14 importer showed no changes of the expression or location induced by iron excess or EPO while DMT1 expression decreased as in others tissues against the Iron Overload stimulus. We can conclude that the heart iron excess would not be mediated by the iron importers ZIP14 and DMT1. Likewise, in the erythropoiesis active model, EPO would have a protective role in the heart decreasing the levels of iron stores independently of DMT1 and ZIP14. In the Iron Overload model in lung the iron uptake increase would be mediated by the apical location of the iron importer DMT1 and the cytoplasmic ZIP14 expression increased. In the EPO condition we observed the DMT1 redistribution to cellular cytoplasma and decrease ZIP14 expression suggesting a lower iron uptake when iron and EPO stimulus cohexist.

In the Iron Overload model in endocrine pancreas the lower expression of DMT1 and the transferrin receptor 1 (TRf1) was observed, which would indicate the existence of a protective mechanism in the Langerhans islets to decrease iron excess uptake. While in exocrine pancreas the acini uptake the iron excess by the increased ZIP14 expression depositing the iron excess by the storage proteins L-ferritin and hemosiderin. We can conclude that in Iron and EPO presence the endocrine pancreas zone is regulate by the iron mechanism while the exocrine pancreas zone is regulate by the EPO signal and in this way it decreases the iron stores due to the great demand of active erythropoiesis. In the Iron Overload studies in neuroblastoma cells SH-SY5Y in NAC ausence we observed that the iron excess induce neuronal died mediated by reactive oxygen species (ROS) while this effect and the iron key proteins expression change induced by ferric amonic citrate (FAC) was be reverted in NAC presence. In Iron Overload the decreased DMT1 expression observed could be mediated by the hepcidin increase, nevertheless this change failed to protect neuronal cells to the iron excess because the iron uptake mediated by ZIP14 and the RTf1 endocyte. A possible hypothesisto explain the neuronal iron excess is the increase in prohepcidin expression in Iron Overload condition that inhibits the iron cellular release by hepcidin-FPN axis. A noteworthy finding of our studies was to demostrate for the first time by immunofluoresce the signalig pathway that induce the hepcidin synthesis by the coexpression of HFE and TRf2. In EPO presence a significative increase in cellular viability was observed, however, this mechanism did ́t be mediated by iron key proteins but could be mediated by another pathways signals that antiapoptotic proteins. The brain studies allow us to demostrate that this tissue have the neccesary mechanims to store iron in excess. Studies performed in the nervous system regions such as the striatum, hippocampus, substantia nigra and cerebellum showed DMT1 decreased expression and ZIP14 increased expression in concordance that we observed in the human neuroblastoma cellular model. However, future studies will be necessary to understand iron homestasis and its regulation in the brain. Finally, the relationship between iron and the cellular proteins in the studied models will contibute to the major comprehension of the mechanism involucrated in the iron cycle physiology and physio phatology.

The protective EPO action observed in neuronal cells and in different tissues in the present tesis work open a new window to use it that a possible treatment in diseases related to iron disorders.