Evidencias genéticas y epigenéticas del control de la apomixis en Eragrostis curvula

Abstract

La apomixis es una forma de reproducción clonal, donde no ocurre ni meiosis ni fecundación para la formación de la semilla. Existe una estrecha relación entre la apomixis y el nivel de ploidía, dado que en la mayoría de las especies que presentan el carácter los genotipos diploides son sexuales y los poliploides son apomícticos y con un grado variable de sexualidad (facultativos). Aunque se sabe que el carácter es regulado por una o más regiones del genoma, se han hallado numerosas evidencias de mecanismos epigenéticos que regulan su expresión. Conocer los factores que determinan la apomixis tendría un gran impacto en la agricultura. Eragrostis curvula (“pasto llorón”) es una gramínea forrajera originaria de Sudáfrica, que incluye genotipos con diferentes niveles de ploidía (2X hasta 8X, con X = 10), que pueden ser sexuales o apomícticos (facultativos u obligados). Nuestro grupo de trabajo realizó numerosos estudios, sobre todo en el carácter apomixis, tanto a nivel de genética estructural como funcional. El objetivo de esta tesis fue contribuir a la dilucidación de las bases genéticas y epigenéticas que regulan uno de los componentes de la apomixis (apomeiosis) en E. curvula. Se desarrolló una población de mapeo segregante para el carácter apomixis a partir del cruzamiento entre dos genotipos tetraploides, uno sexual (OTA-S) y otro apomíctico facultativo (Don Walter). La genotipificación se realizó con marcadores DArT-SNP y el fenotipado mediante citoembriología y un marcador molecular dominante. El mapa de ligamiento quedó conformado por 20 grupos de ligamiento (GL), con el posicionamiento del APO locus en el GL1, donde también se ubicaron tres marcadores SNP 100 % ligados al carácter apomeiosis. La secuencia de los SNP 100 % ligados tienen homología con proteínas anotadas en bases de datos, que podrían estar relacionadas al modo reproductivo. Se realizó un análisis de sintenia entre los GLs del mapa consenso y el genoma de referencia de la especie (cv. Victoria) que permitió asociar todos los GLs a alguno de los contigs y hallar los GLs que corresponderían potencialmente a cada uno de los genomas del alotetraploide (homeólogos). Para la validación de los marcadores se diseñaron y evaluaron cinco primers KASP que permitieron discriminar entre los alelos de los individuos sexuales y apomícticos. En el segundo capítulo se analizaron diferentes resultados obtenidos por el grupo de trabajo que evidencian la influencia de la epigenética sobre el carácter apomixis en plantas de E. curvula. Para analizar la participación de mecanismos de metilación del ADN en la regulación de la apomixis bajo condiciones de estrés hídrico, se realizó un ensayo en el cual muestras de ADN de inflorescencias fueron evaluadas mediante la “Estimación del contenido de metilación por doble corte con enzimas de restricción sensibles” (MCSeEd). En las regiones diferencialmente metiladas se lograron encontrar genes vinculados al modo reproductivo, como BABYBOOM, ubiquitinas, FBox y subtilisinas. Podría afirmarse que tanto el estrés interno como externo ejerce una gran influencia sobre el modo reproductivo de E. curvula, modificando la expresión del carácter apomixis en plantas apomícticas facultativas.

Apomixis is a type of clonal reproduction, where neither meiosis nor fertilization occurs in seed formation. There is a close relationship between apomixis and ploidy level, since in most of the apomictic species diploid genotypes are sexuals and polyploids are apomictics. Usually, apomictic plants are facultative, being some of the seeds sexuals in origin. Although it is known that this trait is regulated by one or more genomic regions, numerous evidences of epigenetic mechanisms that regulate its expression have been found. Knowing the factors that determine apomixis could have a great impact on agriculture. Eragrostis curvula, commonly known as weeping lovegrass, is a forage grass native to southern Africa, which includes genotypes with different ploidy levels (from 2X to 8X, with X = 10) and that can be sexuals or apomictics (facultative or obligate). Our work group carried out several studies on this model species, especially related with the apomixis character, both at the structural and functional genetic level. The objective of this thesis was to contribute to the elucidation of the genetic and epigenetic bases that regulate one of the components of apomixis (apomeiosis) in E. curvula. A segregating mapping population was generated for the apomixis trait from the cross between two tetraploid genotypes, one sexual (OTA-S) and the other one facultative apomictic (Don Walter). Genotyping was performed with DArT-SNP markers and phenotyping using cytoembryological techniques and a dominant molecular marker. The linkage map was made up of 20 linkage groups (LGs), with the apomeisis locus (APO locus) located on GL1, where three SNP markers 100 % linked to the APO locus were also located. All of this 100 % linked SNPs have homology with proteins, two of these annotated in databases. A synteny analysis was performed between the GLs of the consensus map and the E. curvula reference genome (cv. Victoria), which allowed all the GLs to be associated to any of the contigs and to find the GLs that would potentially correspond to each allotetraploid genome (homeologs). For the validation of the markers, five KASP primers were design and performed, allowing to discriminate between the sexual or apomictic alleles of the ndividuals of the mapping population. Furthermore, in a second chapter, several results obtained by the work group were evaluated, demonstrating an influence of epigenetic regulation on the apomixis trait in E. curvula. To analyze the involvement of DNA methylation mechanisms in the regulation of apomixis under water stress conditions, DNA samples of inflorescences under different stress conditions were evaluated, using the “Methylation content sensitive enzime double-digest restriction-site-associated DNA” (MCSeEd) method. Some of the genes identified in the differentially methylated regions were found to be related to the reproductive mode, such as BABYBOOM, ubiquitin, F-box and subtilisin genes. It could be proposed that stress, both internal and external, has a significant influence in the reproductive mode of E. curvula, modifying the expression of the trait in facultative apomicts.