Rol del péptido relacionado a la hormona paratiroidea (PTHrP) en la angiogénesis tumoral y en la transición epitelio-mesénquima de células tumorales intestinales

Abstract

El péptido relacionado a la hormona paratiroidea (PTHrP) está involucrado en la iniciación y progresión de distintos tumores. El rol de PTHrP en células de cáncer colorrectal (CCR) fue abordado en estos últimos años por las Dras. Gentili y Calvo directora y co-directora, respectivamente, de esta Tesis y a partir de los antecedentes generados, en este Trabajo

se propuso investigar los efectos de PTHrP en la angiogénesis y la transición epitelio- mesénquima (TEM) evaluando el comportamiento de las células tumorales y también su

comunicación con su microambiente. Los resultados obtenidos revelan que PTHrP aumenta la expresión de los factores pro-angiogénicos VEGF, HIF-1α, MMP-7 y MMP-9 en las células Caco-2 y HCT116 de CCR y promueve la angiogénesis asociada al tumor a través de VEGF. Estos efectos son mediados por las vías PI3K/Akt y ERK1/2. Previo al inicio de este Trabajo de Tesis se había confirmado que PTHrP induce la activación de β-catenina en estas células de CCR, evento vinculado a la plasticidad celular, por lo que se procedió seguidamente a explorar si PTHrP modula el programa de la TEM. Se observó que en las

células HCT116, PTHrP disminuye la expresión de los marcadores epiteliales CK-18 y E- cadherina y aumenta la expresión de N-cadherina y ZEB-1, proteínas asociadas a un

estado mesenquimal. Además el péptido favorece cambios morfológicos asociados a este estado. El medio condicionado proveniente de las células endoteliales HMEC-1 tratadas con PTHrP (MCE) disminuye la expresión de E-cadherina en las células HCT116 y favorece también un fenotipo mesenquimal sugiriendo que estos MCEs podrían participar de la TEM en las células de CCR. En este Trabajo de Tesis se halló que PTHrP modula la expresión de SPARC, una proteína asociada al fenotipo agresivo de CCR, en las células HCT116. El tratamiento de las células HMEC-1 con PTHrP incrementa la expresión de esta proteína y su secreción al medio extracelular. Además, SPARC exógeno en las células tumorales acentúa el efecto de PTHrP en la disminución de la expresión de E-cadherina y en el incremento de la migración celular. También PTHrP induce cambios en la expresión de microARNs relevantes en la TEM. El péptido administrado a un modelo in vivo promueve cambios morfológicos y moleculares que validan lo observado in vitro. Finalmente mediante un análisis bioinformático en muestras de pacientes con CCR se

observó que los marcadores modulados por PTHrP tanto in vitro como in vivo se vinculan con la progresión de la enfermedad. Los datos presentados en esta Tesis revelan los efectos de PTHrP en la modulación de la angiogénesis y la TEM del CCR y evidencian la importancia de los marcadores estudiados, provenientes del tumor y de su microambiente, en el desarrollo del fenotipo agresivo en los modelos experimentales de CCR empleados. Este trabajo se enmarca dentro de un proyecto global que pretende aportar conocimientos con el fin de orientar en la identificación de marcadores en muestras de pacientes de CCR con potencial valor pronóstico, predictivo y/o con aplicabilidad en el diagnóstico precoz de esta enfermedad.

Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) is involved in the initiation and progression of different tumors. The role of PTHrP in cells from colorectal cancer (CRC) has been addressed in the last years by Dr. Gentili and by Dr. Natalia Calvo director and co-director, respectively, of this Thesis and based on the background information generated, this

Thesis work aimed to investigate the effects of PTHrP on angiogenesis and the epithelial- mesenchymal transition (EMT), evaluating the behavior of tumor cells and also their

communication with tumor microenvironment. The results obtained reveal that PTHrP increases the expression of the pro-angiogenic factors VEGF, HIF-1α, MMP-7 and MMP-9 in Caco-2 and HCT116 cells from CRC and also promotes tumor-associated angiogenesis through VEGF. These effects are mediated by PI3K/Akt and ERK1/2 pathways. Before to start this Thesis, it had been confirmed that PTHrP induces the activation of β-catenin in these CRC cells, and since this event is linked to cell plasticity, then we explored whether PTHrP modulates the EMT program. We observed that in HCT116 cells, PTHrP decreases the expression of the epithelial markers CK-18 and E-cadherin and increases the expression of N-cadherin and ZEB-1, which are proteins associated with a mesenchymal state. In addition, the peptide favors morphological changes associated with this state.

Conditioned medium from PTHrP-treated HMEC-1 endothelial cells (ECM) decreases E- cadherin expression in HCT116 cells and favors a mesenchymal phenotype, suggesting

that these ECMs could participate in the EMT in CRC cells. In this Thesis Work it was found that in HCT116 cells PTHrP modulates the expression of SPARC, a protein associated with CRC aggressive phenotype. The treatment of HMEC-1 cells with PTHrP increases the expression of this protein and its secretion to the extracellular medium. Furthermore, exogenous SPARC treatment on tumor cells accentuates PTHrP effect on the downregulation of E-cadherin expression and in the increment of cell migration. PTHrP also induces changes in the expression of relevant microRNAs in EMT. The peptide administered to an in vivo model promotes morphological and molecular changes that validate the findings obtained in vitro. Finally, through a bioinformatic analysis in samples from CRC patients, we observed that the markers modulated by PTHrP both in vitro as in

vivo are linked to the progression of the disease. The data showed in this Thesis reveal the effects of PTHrP in the modulation of the angiogenesis and EMT program of CRC and show the importance of the studied markers from the tumor and its microenvironment in development of the aggressive phenotype in the experimental models of CRC employed. This work is part of a global project that aims to provide knowledge to help in the identification of markers in samples from CRC patients as potential candidates to be used in the detection of CRC at early stages and/or with prognostic/predictive value of this disease.