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dc.contributor.advisorSpitzmaul, Guillermo Federico
dc.contributor.authorCarignano, Camila
dc.date2023-03-30
dc.date.accessioned2023-05-17T16:29:30Z
dc.date.available2023-05-17T16:29:30Z
dc.date.issued2022
dc.identifier.other2023-1864es_AR
dc.identifier.urihttps://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/6372
dc.description.abstractLa recirculación del potasio (K+ ) es un proceso indispensable para la audición, que tiene lugar en el órgano de Corti (OC). Ante la presencia de estímulos sonoros, el K+ ingresa a las células ciliadas, despolarizándolas. Luego, este ion es extruido de estas células, atravesando las células de soporte y la stria vascularis, desde donde es secretado nuevamente hacia la endolinfa. La salida de K+ de las células ciliadas externas (CCEs) es llevada a cabo fundamentalmente por el canal Kv7.4. Estos están formados por 4 subunidades iguales codificadas por el gen Kcnq4, que se disponen en forma de anillo y delimitan un poro en el centro a través del cual ocurre el paso selectivo de K + . La sordera DFNA2 es causada por mutaciones en Kv7.4. Esta enfermedad se desarrolla como una pérdida auditiva (PA) neurosensorial de herencia autosómica dominante que progresa con la edad, produciendo una sordera leve a moderada en las etapas iniciales, hasta alcanzar una sordera profunda que comienza alrededor de los 50 años en las frecuencias sonoras altas. En sus comienzos, la PA alcanza hasta 60 dB de intensidad, lo cual correlaciona con un mal funcionamiento de las CCEs. Luego, en la adultez, la sensibilidad auditiva disminuye aún más, indicando que otros mecanismos intervienen en la PA. Hasta el momento, no está claro cuáles son las consecuencias a nivel celular y molecular del mal funcionamiento o de la ausencia de los canales Kv7.4 en las células ciliadas. Además, los modelos animales empleados para el estudio de esta patología no han logrado ser útiles para descubrir los eventos que causan la PA avanzada. En esta tesis, se descifraron nuevos roles funcionales que cumplen los canales Kv7.4 en las CCEs y en el oído interno y se dilucidaron los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la degeneración celular en las dos etapas de la sordera. Como modelo de estudio de la enfermedad, se emplearon ratones de la cepa C3H que carecen de la expresión de los canales Kv7.4 (Kcnq4-/-). El capítulo I se enfocó en el análisis de la degeneración tisular en la cóclea de los animales Kcnq4-/-, cuyo alelo se expresó en la cepa murina C3H/HeJ. En primer lugar, analizamos si la expresión de los canales Kv7.4 en la cóclea de los ratones C3H WT y la funcionalidad del sistema auditivo era similar a la reportada para otras cepas. Mediante inmunofluorescencia (IF) y PCR cuantitativa (qPCR) se encontró que esta proteína se localiza en las CCEs del OC y su expresión es más intensa en el giro coclear basal (GCB). A través de la tecnología de super resolución del microscopio confocal, se pudo determinar que estas proteínas se localizan en la membrana plasmática del polo basal de las CCEs mientras que PRESTINA, la proteína motora de las CCEs, se sitúa en la membrana plasmática lateral. A nivel histológico y funcional, se notó que la cepa C3H conserva las células ciliadas y su función auditiva por lo menos, hasta el año de edad, lo cual permitió utilizarla para evaluar los mecanismos que intervienen en la sordera causada por ausencia de Kv7.4, excluyendo la influencia de la edad. En segundo lugar, se realizó la caracterización espacio-temporal de la supervivencia de las células ciliadas mediante citococleogramas y de las neuronas del ganglio espiral (NGEs) en ratones WT y Kcnq4 -/-. Se detectó que en los animales Kcnq4-/-, las CCEs degeneran progresivamente a lo largo de toda la cóclea, comenzando en el GCB a edades jóvenes, tan pronto como a las 3 semanas de edad (W). También se determinó la velocidad de degeneración de las CCEs en las distintas regiones cocleares. Esta es mucho mayor en el GCB y disminuye hacia el ganglio coclear apical (GCA), en correlación con el gradiente de expresión de Kv7.4. El análisis de supervivencia celular reveló que el número de las CCIs disminuye a partir de las 40 W, al igual que las NGEs. Si bien estas células degeneran 37 W más tarde, su velocidad de desaparición es más acelerada. Además, se evaluó la superficie de ambos tipos de células ciliadas a nivel ultraestructural, mediante microscopía electrónica de barrido. Al emplear esta técnica, se descubrieron diferentes alteraciones en los estereocilios de las mismas que podrían afectar la mecanotransducción y transducción de los sonidos, las principales funciones que realizan las CCEs y las células ciliadas internas (CCIs), respectivamente. Por otro lado, se descubrió que Kv7.4 podría contribuir con la compartimentalización de proteínas como PRESTINA. El capítulo II se centró en el estudio de los mecanismos de muerte celular que conducen a la pérdida de las células ciliadas y de las NGEs, en la estimación de la función auditiva de los ratones Kcnq4-/- de distintas edades y en determinar si la sobreestimulación de su sistema auditivo genera mayores daños en el OC. También se evaluó el efecto de una sobreestimulación del sistema auditivo de estos animales mediante un ensayo de trauma acústico. Empleando la técnica de IF, se analizó la vía autofágica y apoptótica. Como resultado, no se encontró activación de autofagia en la cóclea de los Kcnq4-/- jóvenes ni maduros, pero sí se detectó que la apoptosis es una vía activa en las CCEs a edades tempranas y en las NGEs a edades maduras, lo cual contribuye a explicar la disminución en la supervivencia de estas células. Mediante qPCR, se descubrió que los niveles de expresión del gen proapoptótico Bax se encuentran elevados, mientras que los del gen antiapoptótico Bcl-2 están disminuidos en la cóclea Kcnq4-/-. Este hallazgo permite inferir que la activación de la vía apoptótica intrínseca causa la muerte celular en el OC Kcnq4-/-. Para complementar el análisis histológico y evaluar la función auditiva de nuestro modelo animal Kcnq4-/- se realizaron dos ensayos: uno cualitativo y otro cuantitativo. El primero, consistió en la prueba del reflejo de Preyer, que permite estimar si un animal padece de sordera profunda. A través de este, se notó que a medida que progresa la edad, la cantidad de ratones Kcnq4 -/- que no responden al estímulo sonoro, se incrementa. Estos resultados indican que la sordera es progresiva con la edad en los animales Kcnq4 -/-. Las pruebas auditivas cuantitativas incluyeron el test de respuesta auditiva del tronco cerebral (ABRs) y el de emisiones otoacústicas producto de la distorsión (DPOAEs). Se determinó que la función auditiva de los Kcnq4-/- jóvenes está desmejorada ya que los umbrales auditivos aumentaron 20-40 dB en la región coclear de mayor sensibilidad. Además, el ensayo de DPOAEs mostró un aumento de 20 dB en el umbral. Estos datos indican que en etapas tempranas hay un funcionamiento defectuoso de las CCEs. La audición empeora aún más en los Kcnq4 -/- maduros, que mostraron umbrales auditivos mayores a 80 dB, señalando que estos padecen de sordera profunda, lo cual involucra no sólo un mal funcionamiento de las CCEs, sino también de los componentes de la vía auditiva aferente. A nivel histológico, los Kcnq4 -/- jóvenes únicamente mostraron degeneración de las CCEs en el GCB y defectos en los estereocilios de ambas células ciliadas. Mientras que, en los animales de mayor edad, la degeneración de las CCEs progresa afectando toda la longitud del OC, y la supervivencia de las CCIs y NGEs también disminuye en el GCB y ganglio coclear apical. Debido a que los resultados obtenidos a nivel tisular no lograron explicar completamente los obtenidos a nivel funcional, se realizó un análisis supraumbral de los registros de ABR. Este análisis permitió estudiar los mecanismos que intervienen en el procesamiento de la señal auditiva una vez que esta se transmite por la vía aferente, hacia el nervio auditivo. Se determinó que, a edades jóvenes, los ratones Kcnq4 -/- exhiben una reducción en la amplitud de los picos (P) P1, P2 y P5 para frecuencias medias y altas, lo cual revela alteraciones en la transmisión eléctrica de las señales sonoras en el giro coclear medio (GCM) y GCB. Como mecanismos de compensación ante la degeneración celular que ocurre en el OC, descubrimos que existe una hiperactividad a nivel del sistema nervioso central (SNC) para determinadas frecuencias sonoras. A edades maduras, también hallamos que las amplitudes de los distintos picos de la ABR están reducidas, pero a diferencia de lo notado en animales jóvenes, este decremento ocurre a lo largo de toda la cóclea y es generado por la disfunción y degeneración de las CCIs y NGEs. Para analizar la sensibilidad de la cóclea de los animales Kcnq4-/- frente a ruidos intensos, se llevó a cabo un ensayo de trauma acústico. Como resultado, se descubrió que, si bien la exposición a ruidos provocó degeneración y muerte celular de las CCEs por apoptosis en los ratones Kcnq4-/-, estos eventos no provocaron un daño mayor al ya existente debido a la ausencia de los canales Kv7.4. Los hallazgos presentados en esta tesis contribuyen a descifrar los eventos a nivel celular y molecular que intervienen en las distintas fases de la sordera causada por la ausencia de Kv7.4. En la etapa temprana (juvenil) hay una pérdida auditiva leve a moderada. De acuerdo a los mecanismos que se reportan aquí, esta etapa puede subdividirse en tres fases: una temprana, en la que ocurre la disfunción de las células ciliadas debido a despolarización, deslocalización de PRESTINA en las CCEs, y alteraciones en el haz de estereocilios; una intermedia, en la que se activa la vía apoptótica y una tardía, donde tiene lugar la muerte de las CCEs. Finalmente, en la segunda etapa de la PA, hay una sordera profunda producida por la degeneración de las CCIs y NGEs. Si bien existen modelos animales que portan mutaciones equivalentes a las encontradas en humanos, estos no han logrado explicar la PA avanzada. El empleo del ratón Kcnq4-/- nos ha permitido descubrir los eventos que tendrían lugar en ambas fases de la PA, y especialmente, en la segunda, los cuales eran desconocidos hasta el momento. Adicionalmente, estos resultados ayudan a comprender los eventos que subyacen otros tipos de PA que comparten una progresión similar a la sordera DFNA2es_AR
dc.description.abstractPotassium (K+ ) recirculation is an indispensable process for the audition, which takes place in the organ of Corti (OC). In the presence of auditory stimuli, K+ enters the hair cells, depolarizing them. Then, this ion is extruded out from these cells, moving through the supporting cells and the stria vascularis, from where it is secreted again to the endolymph. K+ exit from the outer hair cells (OHCs) is carried out mainly by Kv7.4 channels. These proteins are formed by four equal subunits, which are codified by the Kcnq4 gene, and are arranged in a ring shape, delimiting a pore in the center through which occurs the selective entrance of K+ . DFNA2 deafness is caused by Kv7.4 mutations. This disease develops as a neurosensorial hearing loss (HL) and it inherits as an autosomal dominant disorder, which is progressive through age. It produces a mild to moderate HL in the initial stage until it reaches profound deafness which starts around 50-year-old in the high frequencies. In the beginning, HL reaches an intensity of 60 dB, which correlates with the inappropriate functioning of OHCs. Then, in adulthood, auditory sensitivity reduces, even more, indicating that other mechanisms develop in HL. So far, it is not clear which are the consequences at the cellular and molecular level of the malfunctioning or absence of the Kv7.4 channels in the hair cells. Additionally, the animal models used for the study of this pathology, are not useful to discover the events causing advanced HL. In this thesis, we deciphered new functional roles of Kv7.4 channels in the OHCs and the inner ear and we elucidated the molecular and cellular mechanisms underlying cell degeneration in the two phases of deafness. As an animal model for this disease, we use C3H mice lacking Kv7.4 expression (Kcnq4 -/-). Chapter I focused on the analysis of tissue degeneration in the cochlea of Kcnq4-/- animals, whose allele was expressed in the C3H/HeJ mouse strain. First, we studied if Kv7.4 channel expression in the WT mice and the auditory system function were similar to those reported in other strains. By using immunofluorescence (IF) and quantitative PCR (qPCR) we found that this protein is localized in the OHCs of the OC and its expression is more intense in the basal cochlear turn (BCT). Through the super-resolution technology of the confocal microscope, we determined that these proteins are localized in the plasma membrane of the OHC basal pole, while PRESTIN is situated in the lateral plasma membrane. At the functional and histological level, we discovered that the C3H strain preserves the hair cells and its auditory sensitivity for at least, to one-year-old. This allowed us its use to evaluate the mechanisms participating in the HL caused by Kv7.4 absence, excluding the age factor. Then, we performed the spatio-temporal characterization of the hair cell survival by cytococleograms. and of the spiral ganglion neuron (SGN) survival in WT and Kcnq4 -/- mice. We detected that in young Kcnq4-/- mice, OHCs degenerate progressively along the cochlea, starting at the BCT, as soon as 3-week-old (W). Moreover, we determined the speed of CCE degeneration in the different cochlear regions. This is greater in the BCT and it reduces towards the apical cochlear turn (ACT), correlating with the Kv7.4 gradient expression. The survival analysis revealed that the IHC number reduces from 40 W, in the same way as SGNs. Even though these cells degenerate 37 W later, their velocity of death is more accelerated. Moreover, we investigated the surface of both types of hair cells at the ultrastructural level, by scanning electron microscopy. By using this technique, we discovered different alterations in the hair cell stereocilia, which could affect the mechanotransduction and sound transduction, the main functions of these cells, respectively. On the other hand, we found that Kv7.4 channels may contribute to PRESTIN compartmentalization given that their absence produces its mislocalization. Chapter II focused on the study of the cellular death mechanisms leading to the loss of hair cells and SGNs; on the auditory function estimation of Kcnq4 -/- mice at different time points, and on determining if auditory overstimulation produces more damage in the OC. By IF, we analyzed the autophagic and apoptotic pathways. As a result, we did not find autophagy activation in Kcnq4-/- cochlea from young and middle-aged mice. However, we detected apoptosis activation in the OHCs from young mice and in the SGNs from middle- aged animals, which contributes to explaining their reduced survival. By qPCR, we discovered that the expression levels of the proapoptotic gene Bax are elevated, while those of the antiapoptotic gene Bcl-2 are reduced in the Kcnq4-/- cochlea. These findings allowed us to infer that the activation of the intrinsic apoptotic pathway causes cellular death in the Kcnq4-/- OC. To complement the histological analysis and to evaluate the auditory function in our animal model, we used two tests, one qualitative and the other quantitative. The first one consisted of Preyer’s reflex test, which allowed us to estimate if an animal suffers from profound HL. Through this, we found that as age progresses, the amount of Kcnq4 -/- mice that do not respond to the stimulus, increases. These results indicate that HL is progressive with age in the Kcnq4 -/- animals. The quantitative auditory tests include the auditory brainstem response (ABR) and the distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs). By using these tests, we discovered that auditory sensitivity is impaired in the young Kcnq4 -/- mice given that auditory thresholds elevate 20-40 dB in the most sensitive cochlear region. This data indicates that since young ages there is an altered function of CCEs. The audition impairs even more in the middle-aged mice, which showed auditory thresholds greater than 80 dB, indicating that these animals suffer from profound deafness. This involves not only the malfunction of OHCs but also of the afferent auditory pathway components. At the histological level, young Kcnq4-/- mice showed OHC degeneration in the BCT and stereocilia defects in both types of hair cells. While in the older animals, OHC degeneration progresses affecting the whole length of OC, and the IHC and SGN survival also is reduced in the BCT and ACT. Due to the results obtained at the tissue level not explain completely those obtained at the functional level, we performed a suprathreshold analysis of ABR registers. This analysis allowed us to study the mechanisms involved in the auditory signal processing once this one is transmitted through the afferent pathway to the auditory nerve. We determined that in young Kcnq4 -/- mice, the amplitudes of P1, P2, and P5 are reduced for the middle and high frequencies, revealing alterations in the electric transmission of sound signals in the middle cochlear turn and the BCT. As a mechanism of compensation before the cellular degeneration in the OC, we discovered that there is hyperactivity at the central nervous system level (CNS) for certain sound frequencies. In the middle-aged animals, we noticed that ABR peak amplitudes are also reduced, but differently respecting young animals. The amplitude diminishment was detected along the whole cochlea and is generated by IHC and SGN degeneration and dysfunction. To analyze the auditory sensitivity in the Kcnq4 -/- cochlea to loud noises, we carried out an experiment of acoustic trauma. As a result, we discovered that even though the noise exposure triggered OHC death by apoptosis in the Kcnq4 -/- mice, these events did not generate greater damage than the existing ones due to the lack of Kv7.4. The findings presented in this thesis contribute to deciphering the cellular and molecular events involved in the different phases of deafness caused by Kv7.4 absence. In the early phase, there is a mild to moderate HL. According to the mechanisms reported in this work, this phase can be divided into three phases: early, in which occurs hair cell dysfunction due to its depolarization, PRESTIN mislocalization, and stereocilia alterations; intermediate, in which apoptosis is activated, and late, where CCEs dye. Finally, in the second phase of HL, there is a profound deafness caused by IHC and SGN degeneration. Although there are different animal models carrying human equivalent mutations, these animals did not be able to explain the advanced HL. The use of Kcnq4 -/- mice allowed us to discover the events taking part in both phases of DFNA2 and especially in the second one, which were unknown so far. Additionally, these findings help to understand the mechanisms underlying other types of HL, which share a similar progression with DFNA2 deafnesses_AR
dc.formatapplication/pdfes_AR
dc.format.extent192 h.es_AR
dc.language.isospaes_AR
dc.rightsReconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 (CC BY-NC-ND 4.0)es_AR
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/es_AR
dc.subjectBiologíaes_AR
dc.subjectPotasioes_AR
dc.titleRol de los canales Kv7.4 en la sordera de progresión lenta DFNA2es_AR
dc.typetesis doctorales_AR
bcuns.collection.nameBiblioteca Digital Académicaes
bcuns.collection.acronymBDAes
bcuns.collection.urlhttp://tesis.uns.edu.ar/es
bcuns.collection.institutionBiblioteca Central de la Universidad Nacional del Sures
bcuns.depositorylibrary.nameBiblioteca Central de la Universidad Nacional del Sures
bcuns.author.affiliationUniversidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmaciaes_AR
bcuns.author.affiliationConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas - Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blancaes_AR
bcuns.advisor.affiliationConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas - Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blancaes_AR
bcuns.defense.cityBahía Blancaes
bcuns.defense.provinceBuenos Aireses
bcuns.defense.countryArgentinaes
bcuns.programme.nameDoctorado en Biologíaes_AR
bcuns.programme.departmentDepartamento de Biología, Bioquímica y Farmaciaes_AR
bcuns.thesisdegree.nameDoctor en Biologíaes_AR
bcuns.thesisdegree.grantorUniversidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmaciaes_AR
uns.type.publicationVersionacceptedes_AR
bcuns.depositarylibrary.acronymEUNes
bcuns.subject.keywordsPérdida auditivaes_AR
bcuns.subject.keywordsDegeneraciónes_AR
bcuns.subject.keywordsCélulas celiadases_AR
dcterms.accessRights.openAireinfo:eu-repo/semantics/openAccesses_AR


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