Nanobioinsecticidas : nuevas estrategias para el manejo biorracional de Plodia interpunctella (Lepidoptera, Pyralidae) : desarrollo, aplicaciones y estudios ecotoxicológicos

Abstract

Plodia interpunctella Hübner (Lepidoptera, Pyralidae), también conocida como la polilla de la fruta seca, es un insecto cosmopolita que ocasiona importantes daños en frutas secas, granos, harinas y productos manufacturados derivados. El control de este insecto plaga se realiza tradicionalmente a través de insecticidas de síntesis orgánica. Sin embargo, el uso intensivo de estos productos ha generado varios problemas, entre los que se pueden citar: el desarrollo de resistencia, la contaminación ambiental, daños en la salud humana y la eliminación de potenciales controladores biológicos. Estas circunstancias han llevado a replantear las estrategias de manejo de este insecto y a buscar nuevas metodologías de control, que sean menos perjudiciales para el ambiente y la salud humana. En este contexto, este trabajo propone desarrollar nuevas nanoformulaciones basadas en aceites esenciales (AE) con actividad insecticida en P. interpunctella y evaluar los efectos ecotoxicológicos de estos productos en organismos no blanco tales como Tenebrio molitor y Artemia salina y en células de mamíferos del tipo osteoblástico. En consecuencia, se evaluó la actividad insecticida de los AE de Citrus bergamia Risso (Sapindales, Rutaceae) (Bergamota), Lavandula angustifolia Mill. (Lamiales, Lamiaceae) (Lavanda), Mentha piperita L. (Lamiales, Lamiaceae) (Menta), Geranium maculatum L. (Geraniales, Geraniaceae) (Geranio), Cymbopogon martinii (Roxb.) Wats (Poales, Poaceae) (Palmarosa) y Eucalyptus globulus Labill. (Myrtales, Myrtaceae) (Eucalipto) en larvas del IV estadio y adultos de P. interpunctella. Se utilizaron dos metodologías: exposición a superficies tratadas y aplicación tópica. Los AE de geranio, menta y palmarosa tuvieron los valores de CL50 más bajos en adultos de P. interpunctella para el ensayo de toxicidad por exposición a superficies tratadas. Sin embargo, para el caso de las larvas del IV estadio tanto en el ensayo por exposición a superficies tratadas como en el ensayo por vía tópica, ningún AE mostró una mortalidad mayor al 20%, incluso a las máximas dosis. Finalmente y en el caso particular de los adultos de P. interpunctella que se trataron por vía tópica se observó que la variabilidad de los resultados obtenidos fue muy grande. Por esta razón se descartó para el resto de la tesis este tipo de ensayos en adultos. En base a los datos obtenidos en el ensayo por exposición a superficies tratadas en adultos de P. interpunctella se procedió a seleccionar a los AE de geranio, menta y palmarosa para ser nanoformulados. En lo que respecta a la obtención de nanopartículas (NP) poliméricas, se eligió al PEG-6000 como sustrato matricial y mediante el método de fusión-dispersión se obtuvieron las NP de PEG-6000 cargadas con AE (NPAE). Las NPAE de palmarosa tuvieron un tamaño de 191 nm, mientras que las de geranio de 259 nm. Ambas NP mostraron una eficiencia de cargado (EC) cercana al 90% y fueron monodispersas. Por su parte, las NP de menta tuvieron un tamaño de 380 nm, fueron polidispersas y su EC fue del 72%. Una vez obtenidas las NPAE se probaron mediante ensayos de exposición a superficies tratadas y por exposición a vapores en larvas del IV estadio y adultos de P. interpunctella. Además se estudió, en ambos ensayos, el efecto de la temperatura de post-aplicación a 17, 24 y 31 °C. Uno de los resultados más destacables es que a todas las temperaturas, las NPAE potenciaron el efecto insecticida por exposición a superficies tratadas en adultos P. interpunctella, en relación con los AE libres, entre 1,54 y 3,54 veces. Por otra parte, en el caso del ensayo por exposición a vapores, solo las NPAE de palmarosa y menta incrementaron el efecto insecticida de los AE, entre 1,26 y 4,45 veces. Sin embargo, es para destacar que el AE de palmarosa fue el que mostró el mayor efecto insecticida y su temperatura óptima de post aplicación fue de 17 °C. A su vez, sus NPAE también presentaron a esta temperatura la mayor actividad insecticida convirtiéndose así en las más efectivas de este estudio. Finalmente, se demostró que la temperatura tuvo un efecto significativo sobre la actividad insecticida de los AE y de sus NP cuando estos productos se usaron en el ensayo por exposición a superficies tratadas sobre adultos de P. interpunctella. No se registró efecto alguno de la temperatura post-aplicación cuando las NPAE se emplearon en los ensayos por exposición a vapores. Los AE de geranio, menta y palmarosa también se formularon como nanoemulsiones (NEs) utilizando Tween 80 como surfactante y la técnica de ultrasonido. Para la elaboración de las NEs las condiciones optimizadas de la sonda ultrasonido fueron: 65 W de potencia, ciclos de 30 “on”/ 20 “off”, tiempo total de sonicación de 2 min y distancia óptima de la sonda ultrasónica de 3,7 cm. En lo que respecta a estas formulaciones, las NEs de geranio elaboradas con una relación AE:Tween 80 de 1:2 tuvieron tamaños de gota de ≈14 nm, fueron monodispersas, de aspecto transparente y comenzaron a perder su estabilidad a los 120 días. En cuanto a las NEs de menta formuladas con una relación AE:Tween 80 de 1:2 mostraron tamaños de gota ≈33 nm, fueron polidispersas y de aspecto macroscópico transparente. En cuanto a la estabilidad de estas NEs, se observó un proceso de separación de fases a los 60 dias de haber sido formuladas. Finalmente los nanosistemas elaborados con el AE de palmarosa no fueron estables ni translúcidos con la relación AE: Tween 80 de 1:2. Es por esto que para no modificar las condiciones de ultrasonido, se procedió a enriquecer la mezcla con acetato de linalilo (AL). Cuando este componente enriqueció al AE de palmarosa en un 50%, se obtuvieron NEs con tamaños de gota de ≈14 nm, monodispersas, de aspecto macroscópico transparente y estables durante 120 días. En relación a la actividad insecticida de estos productos, los resultados mostraron que las NEs combinadas con β-cipermetrina potenciaron el efecto tóxico, con respecto al piretroide solo y a este combinado con los AE en larvas del IV de P. interpuctella. Por otra parte se estudiaron aspectos ecotoxicológicos de las NAPAE y NEs a través de ensayos con distintos organismos no blanco y en células de mamíferos. Con respecto a las NPAE y a las NEs se observó que estas nanoformulaciones no generaron efectos tóxicos a las dosis ensayadas en larvas de Tenebrio molitor L. Coleoptera, Tenebrionidae). En cuanto a los estudios de las nanoformulaciones en Artemia salina L. (Anostraca, Artemiidae) los resultados fueron heterogéneos. Por un lado, las NPAE del AE de geranio resultaron ser inocuas, mientras que las NEs de este AE tuvieron una alta toxicidad en este crustáceo, incluso a bajas dosis. El caso contrario fue el de las NPAE de menta y palmarosa que resultaron ser tóxicas a bajas dosis (< 25ppm). Sin embargo, las NEs de menta y palmarosa + AL mostraron valores de CL50 muchos más altos que los encontrados en el ensayo con Cx. p. pipiens, demostrando una toxicidad diferencial. Con respecto a los estudios relacionados con las células de mamíferos de tipo osteoblástico, luego de 24 h, las NEs de menta y palmarosa + AL redujeron la viabilidad celular levemente, siendo este efecto aún más pronunciado con las NEs de geranio. Luego de 72 h, las células expuestas a Tween 80 y a las NEs de menta y palmarosa + AL, exhibieron un aumento significativo en la viabilidad celular en comparación con las células del control. Por otra parte, las NEs de geranio redujeron significativamente la viabilidad celular. Finalmente a las 168 h, solo las NEs de geranio redujeron significativamente la viabilidad celular. A estos tiempos de exposición no se hallaron diferencias significativas entre el resto de los tratamientos y los controles. En el marco del desarrolloo de nuevas estrategias de manejo de insectos plaga, las nanoformulaciones basadas en AE han incrementado su importancia como nuevos insecticidas bioracionales. Según los resultados obtenidos las NPAE y NEs, elaboradas en el marco de esta tesis, son practicamente atóxicas para organismos no blanco, como A. salina y T. molitor y podrían considerarse bioinsecticidas potenciales para el manejo integrado de P. interpuctella.

The Indian meal moth, Plodia interpunctella Hübner (Lepidoptera, Pyralidae) is a cosmopolitan major economic insect pest of stored products. The larvae prefers to feed on broken grains and especially on milled products such as flour, breakfast foods, stored cereal products, dried vegetables and fruits, processed foods and meals. Generally, the control of this insect pest in storage systems depends on synthetic insecticides. However, their indiscriminate application contributed to environmental contamination and pest resistance and affected nontarget organisms. Essential oils (EO) appear as new ecofriendly insecticides, which show good biological activity against insect pest. Consequently, they become a complementary method for integrated pest management strategies (IPM). The overall objective was to develop new bioinsecticides nanoformulations that can be used for a safer management of P. interpunctella as well as an improvement in the knowledge of the econanotoxicological field. This study evaluated the chemical constituents and bioactivity of six essential oils namely Citrus bergamia Risso (Sapindales, Rutaceae) (Bergamot), Lavandula angustifolia Mill. (Lamiales, Lamiaceae) (Lavender), Mentha piperita L. (Lamiales, Lamiaceae) (Peppermint), Geranium maculatum L. (Geraniales, Geraniaceae) (Geranium), Cymbopogon martinii (Roxb.) Wats (Poales, Poaceae) (Palmarosa) and Eucalyptus globulus Labill. (Myrtales, Myrtaceae) (Eucalyptus) against larvae IV and adults of P. interpunctella. The EO were topically applied or were evaluated in contact toxicity bioassays. The contact toxicity order was palmarosa > geranium > peppermint > lavender > bergamot > eucalyptus in adults of P. interpuctella. However, when EO were topically applied or were evaluated in contact toxicity bioassays against larvae IV, the EO showed less than 20% of mortality even at the highest doses. In topically assays with P. interpunctella adults, the results were variable. In this sense, topically assays with P. interpunctella adults were not performed in the thesis. Based on these results, geranium, peppermint and palmarosa oils were further evaluated for essential oils polymeric nanoparticles (EOPN) and nanoemulsion (NEs) elaboration. EOPN were elaborated by the melt-dispersion method using polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) as matrix system in PEG 6000: EO ratio 10: 1. The first step of the study was the characterization of the EOPN. The EOPN sizes from palmarosa were 191 nm, followed by geranium (259 nm) and peppermint EOPN (381 nm). Palmarosa and geranium EOPN were monodisperse and the loading efficiency (LE) showed values close to 90%. On the other hand, peppermint EOPN were polydisperse and the LE was > 70%. The aim of second chapter was to evaluate the insecticidal activity of EO and EOPN on P. interpunctella adults at different environmental temperatures (17, 24 and 31 °C). In the contact toxicity bioassay, all EOPN significantly increase the insecticidal activity of the bioactive compounds from 1.54 to 3.54 times. In the case of fumigant assays, just palmarosa and peppermint potentiated the biological activity from 1.26 to 4.45 times. It has been found that palmarosa EO and EOPN presented the highest insecticidal activity and the optimal post application temperature was 17 °C. It was also observed that the temperature had a significant effect on the insecticidal activity of the EO and EOPN when applied by contact. However, this effect could not observe in fumigant bioassay. Geranium, peppermint and palmarosa EO were also formulated as nanoemulsions (NEs) using Tween 80 (surfactant) and ultrasound. For NEs elaboration, the ultrasound parameters were optimized: ultrasound power = 65 W, sonication time = 2 min, cycles = 30 on/20 off and ultrasonic probe distance = 3.7 cm. Transparent NEs of geranium EO were achieved using 1:2 oil-surfactant ratios. These nanosystems measured 13.58 nm, were monodisperse and stable for 60 days. Moreover, after 120 days of storage, NEs began to lose stability. In case of peppermint EO, transparent NEs were formulated using a 1:2 peppermint EO/Tween 80 ratio. These NEs showed sizes of 33.97 ± 33.16 nm and the PDI value of 0.424 ± 0.008, and were stable after 30 days. The NEs lost stability after 60 days. It is important to point out that the palmarosa EO alone at the highest Tween 80 ratio (1:2) was unable to produce stable and transparent NEs. The addition of linalyl acetate (LA) to the coarse emulsion made the NEs production possible with the same ultrasound parameters. When the ratio of LA was 50%, the palmarosa + LA NEs were transparent. Moreover, the NEs measured 14.73 nm and were monodisperse. According to bioassays, the NEs combine with β-cypermethrin enhance the toxicity of EO against larvae IV of P. interpunctella. Finally, it was also evaluated the potential influence of EOPN and NEs on the non target aquatic model Artemia salina, L. (Anostraca: Artemiidae), and on the terrestrial model Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae). The results from the ecotoxicology assay in T. molitor indicated that EOPN and NEs did not have toxic effect on this terrestrial model. However, the ecotoxicology assay in A. salina showed different results. On the one hand, geranium EOPN were not harmful for A. salina; on the other hand, NEs were toxic even at the lowest doses. Nevertheless, peppermint and palmarosa EOPN were toxic even at the lowest doses, though their NEs showed CL50 values higher than the values found in Cx. p. pipiens assay. In the context of the biosafety evaluation of these novel nanofomulations, the viability of cell culture exposed to NEs was also evaluated. After 24 h, the treated cells with peppermint and palmarosa + AL NEs showed a significant slowdown on the cell viability rate. The geranium NEs had a stronger effect in this variable. Nevertheless, after 72 h, cells exposed to Tween 80 and NEs exhibited a significant increase in the cell viability rate compared with control. However, geranium NEs showed a higher reduction in the cell viability rate. After 168 h, the NEs did not have a significant effect on the cell viability when compared with control and control + Tween 80. Though, the geranium NEs showed similar results as 72 h assay. The potential uses of nanoformulations based on EOs as novel bioinsecticides responds to the new socioproductive conditions and fulfill the demands of new ecofriendly pest management tools. In this sense, this work shows that the EOPN and NEs are relatively safe for nontarget organisms, such as A. salina and T. molitor and could be act as a new bioinsecticides for the management of P. interpunctella.