Control de la apoptosis en neuronas fotorreceptoras obtenidas a partir de células madre

Abstract

Dentro de la estructura del ojo de los vertebrados, la retina es tal vez el tejido que más capta la atención de los científicos por ser el primer actor en la recepción y transmisión del estímulo visual. La retina si bien forma parte de un sentido periférico, posee gran cantidad de homologías con el Sistema Nervioso Central. Esto provoca que los eventos y patologías asociadas a la retina puedan, hasta cierto punto, relacionarse con las enfermedades neurodegenerativas del cerebro más difíciles de estudiar como son el mal de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. En el caso particular de la retina, existen dos enfermedades aún hoy incurables como son la Retinitis Pigmentosa (RP) y la Degeneración Macular asociada a la Edad (AMD, por sus siglas en ingles). La muerte de las neuronas fotorreceptoras cumple un rol fundamental en el desarrollo de estas enfermedades, que se basan en la pérdida gradual y prácticamente irreversible de la visión. En la retina, las células gliales de Müller proveen el sostén necesario para la estructura de la misma. Se ha reportado que estas células expresan marcadores de células madre por lo cual están involucradas en la regeneración de la retina ante un eventual daño. Existen ya terapias destinadas a estimular el desarrollo de dichas células madre. Sin embargo, aún es necesario un mayor avance en la búsqueda de tratamientos destinados al mantenimiento y posterior diferenciación de las células regeneradas, evitando el proceso de muerte al que están expuestas. En otras palabras, evitar que las neuronas fotorreceptoras sean sometidas al proceso de suicidio celular conocido en líneas generales como Apoptosis. Dentro del enorme abanico de causas que pueden generar apoptosis en una neurona, la falta de factores tróficos o de crecimiento es una de ellas. Este trabajo de tesis buscó revertir la muerte provocada por la falta de factores tróficos en un modelo de cultivo neuronal puro compuesto en su mayor proporción por neuronas fotorreceptoras. En la primera parte nos enfocamos en estudiar el rol de la Melatonina como agente neuroprotector. Los resultados apuntan a que la Melatonina resulta eficaz para disminuir el avance de la apoptosis a días avanzados en el desarrollo. Pudimos demostrar que el efecto que la Melatonina ejerce específicamente en neuronas fotorreceptoras, está dado por la activación de la vía de señalización de ERK/MAPK. Respecto a la capacidad de la Melatonina de mantener la población de neuronas fotorreceptoras, no se vio un aumento en la expresión de proteínas del ciclo visual. Por el contrario, se observó un aumento de la expresión génica del factor de transcripción CRX (Cone Rod Homeobox) que ayudaría a mantener el fenotipo de neuronas fotorreceptoras a aquellas que hayan iniciado el proceso de diferenciación. Estos resultados sugieren que la Melatonina, podría ejercer su acción protectora directamente en las neuronas fotorreceptoras, e indirectamente, a través del estímulo de la población de neuronas que acompaña a los fotorreceptores en el ciclo visual, como ser las células amacrinas. La segunda parte de este trabajo se enfocó en la caracterización de la vía de muerte por falta de factores tróficos. En ese sentido, la vía de NO-GAPDH-SIAH consiste en la translocación a núcleo de la enzima GAPDH y el posterior desencadenamiento de la muerte celular. Comprobamos que efectivamente en nuestro modelo se verifica la translocación nuclear; y que al pre-tratar los cultivos con un inhibidor selectivo de dicha translocación se recupera significativamente la perdida de la viabilidad en los cultivos neuronales. Los resultados de esta tesis por un lado enriquecen el conocimiento sobre el rol de la Melatonina como agente neuroprotector en la retina. Por otro lado contribuyen a esclarecer los mecanismos de muerte en las células de la retina ante la falta de factores tróficos para poder, en un futuro, unificar su tratamiento.

The retina is probably the most interesting tissue within the structure of vertebrate eye, given its role as the first one in charge of receiving and transmitting the visual stimuli. Even though the retina is part of a peripheral sensory system, it shares many homologies with the Central Nervous System. This allows correlating to some extent the pathologic events associated with the retina with neurodegenerative illness more difficult to study such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. There are two main disorders of the retina named Retinitis Pigmentosa and Age-related Macular Degeneration. Those two pathologies share a common trait which is the death of photoreceptor cells as the main cause of gradual and irreversible loss of vision. In the retina, Müller glial cells are in charge among other functions, to support and maintain the structure of the retina. It has been reported for this cells the expression of stem cell markers and the involvement on retina regeneration after damage. Even though there are treatments nowadays that aim to stimulate Müller glia development of their stem potential, treatments aiming to the maintenance and ulterior differentiation of newly regenerated cells are just as important. The general idea is to prevent newly generated photoreceptor cells to undergo cell suicide, also known as Apoptosis. Within the large range of causes that can trigger apoptosis on a neuron, the lack of growth factors is one of them. In this thesis we aim to revert photoreceptor cell death induced by lack of growth factors, on a model of pure neuronal cultures. On the first chapter we focused on assessing the role of Melatonin as a neurotrophic factor. Results showed that Melatonin is effective on slowing down the apoptotic pathway after 4 days of development. We proved the involvement of Melatonin on the activation of the ERK/MAPK pathway directly on photoreceptor cells. Regarding Melatonin as a factor promoting neuronal differentiation, we could not observe an overexpression of visual cycle proteins. On the other hand, we observed the genetic overexpression of a transcription factor (Cone Rod Homeobox) which will help maintain the phenotype of those neurons that started developing as photoreceptors. Our results suggest that Melatonin could accomplish neuroprotection by either acting directly on photoreceptor cells, or indirectly through engaging the neurons that aid said cells on the visual cycle. The second part of this thesis focuses on the characterization on the cell death pathway caused by lack of trophic factors. On that matter, the NO-GAPDH-SIAH pathway consist in nuclear translocation of the glycolytic enzyme GAPDH followed by onset of neuronal death. We found that nuclear translocation of GAPDH occurs in our model, and that by pre-treating cultures with R-(-)-Deprenyl (a selective inhibitor for such translocation), we recovered neuronal cultures from loss of cell viability. The results shown on this thesis on one hand contribute to deepen the knowledge of Melatonin as a neuroprotective agent in the retina. On the other hand they shed light into the mechanisms involving neuronal death on lack of trophic factors so we may, in the future, unify their treatment.