Desarrollo y aplicación de estrategias de optimización para el diseño óptico de redes metabólicas y procesos biotecnológicos

Abstract

Las cianobacterias tienen potencial como productoras de biocombustibles y otros productos químicos, ya que pueden crecer utilizando el CO2 presente en la atmósfera como fuente de carbono, la luz como fuente de energía y el agua como fuente de electrones. Esto resulta atractivo en el contexto actual de cambio climático ocasionado por las elevadas concentraciones de CO2 en la atmósfera. En esta tesis se estudia la producción de etanol de cuarta generación y polihidroxibutirato (PHB) a partir de la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803, con un enfoque de Ingeniería de Sistemas Metabólicos. En primer lugar, se cura un modelo estequiométrico de escala genómica (GEM) de dicha cianobacteria con información bibliográfica específica actualizada, con el objetivo de mejorar las predicciones in silico. Luego, el GEM es validado frente a datos experimentales fisiológicos y datos de fluxómica, demostrándose que la curación resulta efectiva en mejorar las predicciones del modelo. Con el modelo curado y validado, se formulan problemas de programación binivel para buscar estrategias de acoplamiento, a través de la supresión de genes, entre el crecimiento y la producción del compuesto de interés con el objetivo de convertir al metabolito deseado en un subproducto obligado del crecimiento y que en consecuencia, su producción resulte una parte integral de la función metabólica del organismo. Matemáticamente, las intervenciones genéticas se representan por medio de variables binarias asociadas a dichos genes. Estos problemas son reformulados por medio de la teoría de la dualidad, obteniéndose como resultado problemas de programación mixta entera lineal (MILP) en un solo nivel que se resuelven tanto para el caso de etanol como para el de PHB. Existen en bibliografía formulaciones de este tipo, aunque con variables binarias asociadas a reacciones. El aporte realizado en esta tesis al incorporar asociación de variables binarias a genes es un avance en el agregado de información biológica a este tipo de formulaciones. En el caso del etanol se obtienen dos mutantes factibles que presentan diferentes estrategias de intervención para acoplar la producción al crecimiento, una relacionada con la producción de acetato y la otra, con el balance celular de poder reductor, siendo el segundo caso el más prometedor desde el punto de vista biotecnológico ya que aumenta en un 235 % la productividad de la cepa con respecto a las productividades presentadas en bibliografía. Para este producto, también se estudia la posibilidad de producción con una estrategia en dos etapas. En dicha estrategia, se considera un primer biorreactor con condiciones que maximicen el crecimiento y un segundo biorreactor donde un nutriente limita dicho crecimiento y se favorece la producción de etanol. Esta estrategia mejora aún más los índices de producción. En el caso de PHB también se obtienen dos mutantes factibles, pero la estrategia de acoplamiento no varía. La diferencia entre ambos son dos intervenciones más, que hacen que la tasa de producción de PHB aumente un 25%. La estrategia, en este caso, también está relacionada con el balance de poder reductor de la red, pero se observan mayores cambios en los flujos metabólicos internos que para el caso del etanol. La productividad del mejor mutante se analiza en condiciones de exceso y de limitación de nutrientes. Las productividades obtenidas vuelven atractiva la realización de experimentos in vivo para avanzar en el diseño de cepas de Synechocystis como fábricas celulares de etanol de cuarta generación y de bioplásticos. Los modelos desarrollados constituyen herramientas útiles para el diseño de cepas industriales para la producción fotosintética no solo de biocombustibles y bioplásticos, sino también de compuestos de interés en una gran variedad de industrias como la farmacéutica, la nutracéutica, de biofertilizantes, entre otros.

Cyanobacteria are potential candidates for biofuel and chemical product production, due to their ability to grow autotrophically, on the atmospheric CO2 as carbon source, light as energy source, and water as electron source. These capacities become attractive in the current climate change context, caused by the high concentrations of CO2 in the atmosphere. In this thesis, the production of fourth generation ethanol and polyhydroxybutyrate (PHB) from the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 is studied through a Systems Metabolic Engineering approach. First, a genomic scale stoichiometric model (GEM) of Synechocystis is curated, based on specialized and actualized bibliography, to improve the in silico predictions. Then, the GEM is validated against physiological and fluxomic data. After model curation and validation, bilevel programming problems are formulated, to determine genetic engineering strategies to couple growth and bioproduct production by gene knock-outs. The aim of coupling production is turning the biotechnological compound into an obligate subproduct of growth, so that its production becomes an integral part of the organism’s metabolic function. Mathematically, knock-outs are represented by binary variables associated to the corresponding genes. This bilevel programming problems are reformulated into one level Mixed Integer Linear Programming (MILP) problems by applying the duality theory, and are solved for both ethanol and PHB cases. Considering binary variables associated with genes instead of reactions is a novel contribution of this thesis. and constitutes a step towards the incorporation of biological meaning into in silico results. For the case of ethanol, two feasible mutants are obtained, with different intervention strategies to couple production to growth. One of the strategies is related to acetate production and the other with the cellular reductive power balance. The latter is the most promising case from a biotechnological point of view, because it gives a productivity 235%.higher than those reported in bibliography. Also, a two-stage ethanol production strategy is addressed, where a first bioreactor with growth maximizing conditions and a second one with nutrient limiting conditions are considered. This strategy further improves production indexes. In the case of PHB, two feasible mutants are obtained with similar coupling strategies. The difference between them are two interventions that improve PHB production rate by 25%. The strategy in this case is also related with the cellular reductive power balance, but more changes in the internal metabolic fluxes are required, as compared to the ethanol case. The productivity of the best mutant is analyzed under excess and limiting nutrient conditions. The results obtained are encouraging to make further in vivo experiments to move forward in the design of Synechocystis as a microbial cell factory of fourth generation biofuels and bioplastics. The models developed in this thesis constitute useful tools for the design of industrial strains for the photosynthetic production of not only biofuels and bioplastics, but also of compounds of interest with application in a wide range of industries like pharmaceutical, nutraceutical and biofertilizers, among others