Regulación de la expresión de proteínas morfogenéticas óseas por el trifosfato de adenosina en osteoblastos de rata pre y post infección con virus de sarampión y Junín : rol de receptores P2 y mecanismos de señalización

Abstract

El conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la modulación de las funciones biológicas de los osteoblastos, células responsables de la formación de hueso, es indispensable como punto de partida para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas aplicables en las patologías óseas. La acción del trifosfato de adenosina (ATP) sobre los receptores purinérgicos de la membrana plasmática ha mostrado regular importantes funciones celulares de los osteoblastos. Los resultados expuestos en esta Tesis describen por primera vez, el efecto del ATP sobre la expresión de proteínas inductoras de formación de hueso en osteoblastos de calvaria de rata (OBCs), como así también la modulación de dicho suceso por la infección con los virus de Sarampión (MEV) y Junín (JUNV). Mediante diferentes técnicas, como ensayos de proliferación, determinación de deposiciones de calcio, citometría de flujo y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, se demostró que la activación por ATP de los receptores P2Y2 estimula la proliferación y diferenciación de los OBCs. Además, se observó que estos receptores modulan positivamente la expresión de proteínas asociadas a la diferenciación osteoblástica como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP-2, 4, 5 y 7), sialo-proteína ósea, colágeno y fosfatasa alcalina. Se demostró la participación de la vía de la fosfatidil inositol 3 quinasa / proteína quinasa B (PI3K/AKT) en la estimulación inducida por el ATP sobre la proliferación y diferenciación de los OBCs. También, el empleo de diferentes nucleótidos sugiere que la expresión génica de BMP-1, 3, y 6 estaría regulada por los subtipos P2Y6, P2Y4,1,12,13 y P2Y6,1,12,13 respectivamente. Además, por técnicas de microscopía convencional y de fluorescencia, western blot y ensayos de infectividad, se demostró que MEV o JUNV pueden infectar a los OBCs y modular la expresión de varias proteínas relacionadas con la diferenciación de los osteoblastos. La infección con MEV mostró analogía con datos reportados en la literatura, de biopsias de pacientes con otosclerosis, enfermedad de los huesecillos del oído que causa sordera. Sin embargo, a diferencia de lo observado para el tratamiento con ATP, esta modulación no ocurre a través de la vía PI3K/AKT. La activación de los receptores P2Y1, 12, 13 inhibe la multiplicación o liberación de MEV. En cambio en el caso de los OBCs infectados con JUNV, los tratamientos con nucleótidos no modificaron los títulos virales, sin embargo, generaron péptidos truncados derivados de la nucleoproteína viral característicos de la infección persistente de cultivos celulares por JUNV. Asimismo, se comprobó la capacidad de JUNV de infectar persistentemente a los OBCs. Estos resultados permiten especular acerca de las probables alteraciones inducidas por el virus en la respuesta de los OBCs a estímulos externos y ubica a estos sistemas virus-célula como modelos de estudio de enfermedades óseas de probable etiología viral como la otosclerosis. Los resultados aquí presentados contribuyen a la comprensión de los mecanismos involucrados en la modulación de la proliferación y maduración de osteoblastos por receptores purinérgicos y también como respuesta a la infección viral.

The knowledge of molecular mechanisms involved in the modulation of osteoblasts biological functions, cells responsible for bone formation, is essential as a starting point to design new therapeutic strategies applicable in bone diseases. The adenosine triphosphate (ATP) action on purinergic receptors of plasma membrane has shown to regulate important cellular functions in osteoblasts. The results presented in this thesis describe, for the first time, the ATP effect on the expression of proteins related to bone formation in rat calvarial osteoblasts (OBCs), as well as the modulation of this event when infected with Measles (MEV) and Junin (JUNV) virus. Using different techniques, such as proliferation trials, calcium deposition determination, flow cytometry and realtime quantitative polymerase chain reaction, it was demonstrated that the P2Y2 receptor activation by ATP, stimulates OBCs proliferation as well as differentiation. Moreover, it was observed that these receptors positively modulate those proteins associated with osteoblast differentiation such as bone morphogenetic proteins (BMP-2, 4, 5 and 7), bone sialoprotein, collagen and alkaline phosphatase. It has been demonstrated that the phosphatidyl inositol 3 kinase / protein kinase B (PI3K/AKT) pathway is involved in the proliferation and differentiation of OBCs. The use of different nucleotides also suggests that BMP-1, 3, and 6 gene expression would be regulated by P2Y6, P2Y4, 1, 12, 13 and P2Y6, 1, 12 and 13 subtypes receptors respectively. In addition, by conventional microscopy and fluorescence techniques, western blot and infectivity assays, it was demonstrated that both viruses are able to infect OBCs and modulate several proteins related to these cells differentiation. These results are in accordance with reports dealing with biopsies from patients suffering otosclerosis, a human disease of the ear ossicles which causes hearing impairment. However, by contrast to that observed for the treatment with ATP, viral modulation does not occur via PI3K/AKT. The P2Y1, 12, 13 receptors activation inhibit the MEV release or multiplicity; however in the case of OBCs infected with JUNV, the treatments with different nucleotides did not modify the viral titer but it induced the appearance of truncated peptides derived from the viral nucleoprotein, a salient feature of persistent infection of JUNV in vitro. In addition and accordance to the results shown here, JUNV was able to infect OBCs, persistently. On the other hand, results allow speculation about the viral modulation of OBCs response to external stimuli and the perspectives of viruscell systems as useful models in the study of otosclerosis, a bone disease associated to viral infection. The results presented here contribute to understand the mechanisms involved in the modulation of proliferation and maturation in osteoblasts by purinergic receptors as well as in response to viral infection.