Propiedades biofísicas de esfingomielinas y ceramidas con ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena

Abstract

Los esfingolípidos de las células germinales y espermatozoides de mamífero son inusuales por contener una alta proporción de ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena (VLCPUFA). En las gametas de rata, la esfingomielina (SM) y la ceramida (Cer) contienen especies con ácidos tetraenoicos y pentaenoicos de la serie n-6 de hasta 32 carbonos, en versiones no hidroxiladas (n-V) y 2-hidroxiladas (h-V). Estudios previos habían mostrado que las SM con VLCPUFA se forman en las células espermatogénicas, que la relación entre h-V SM y n-V SM aumenta con la diferenciación celular, y que ambas terminan localizadas específicamente en las cabezas espermáticas. Posteriormente se vio que estas SM disminuyen a medida que aumentan las Cer en las gametas de rata durante reacciones que ocurren en etapas claves de la fertilización, en especial durante la reacción acrosomal. El objetivo de este trabajo fue contribuir al conocimiento de las propiedades biofísicas de estos inusuales esfingolípidos y a determinar cómo estas propiedades cambian como resultado de dichos eventos bioquímicos. Nuestro primer desafío fue obtener estas relativamente minoritarias especies moleculares en suficiente cantidad y aceptable pureza. Para ello tomamos ventaja de su estructura química. Así, fracciones conteniendo especies de n-V SM y h-V SM se separaron de las mayoritarias SM saturadas y monoenoicas teniendo en cuenta el alto número de dobles ligaduras de sus ácidos grasos. Luego, de la primera fracción se obtuvieron especies de SM con n-28:4, n-30:5 y n-32:5, y de la segunda especies con h-28:4, h-30:5 y h-32:5, aprovechando las diferencias de hidrofobicidad entre estos ácidos grasos. Estas fracciones y especies se incluyeron en sistemas modelo de bicapa y monocapa, y se estudiaron aplicando metodologías e instrumentación previamente validadas para especies de SM con 16:0, 18:1, o 24:1. Un enfoque similar se aplicó para estudiar las especies de las fracciones n-V Cer y h-V Cer. Al estudiarlas por espectroscopía de fluorescencia, tanto la polarización generalizada (GP) del Laurdan como la anisotropía de fluorescencia (r) del DPH mostraron que la mayoría de las n-V SM y h-V SM compartieron la característica de tener temperaturas de transición (Tt) muy bajas, por debajo de 5 °C, salvo n-32:5 SM y h-32:5 SM, cuyas Tt fueron cercanas a los 22 °C. El aumento en la Tt que podría esperarse debido al inusual largo de la cadena acílica, es pues contrarrestado por la presencia de varias dobles ligaduras en estos ácidos grasos. Estos estudios indicaron que las cadenas acilicas de estas especies se encuentran en un estado desordenado a temperatura fisiológica. Las h-V SM exhibieron mayores valores de GP y de r que las correspondientes especies n-V SM, indicando que el grupo hidroxilo en las primeras tiende a promover las interacciones intermoleculares, probablemente a través de la formación de uniones tipo puente hidrógeno. Las interacciones entre las SM con VLCPUFA y otros lípidos se investigaron empleando sistemas modelo multicomponente en forma de bicapa. En bicapas formadas por dimiristoíl-PC y estas SM, se concluyó que éstas últimas jugarían el rol de lípidos “fluidificantes”, en discrepancia con la noción generalmente aceptada de que en las membranas celulares las SM son las que restringen la movilidad de otros lípidos. En sistemas conteniendo dioleoil-PC, colesterol y n-V o h-V SM, ninguna de éstas tendió a segregarse en dominios condensados enriquecidos en SM/colesterol a temperatura ambiente, tal como sí lo hizo claramente la 16:0 SM. Las dos estrategias experimentales sugirieron que a temperatura fisiológica y en membranas naturales donde las SM con VLCPUFA coexisten con otros lípidos, como es el caso de la membrana plasmática de la cabeza espermática, estas especies no se concentrarían en áreas de la membrana ricas en colesterol, sino en áreas ricas en glicerofolípidos poliinsaturados, esto es, en dominios más “desordenados” de la membrana. Una valiosa información acerca de las propiedades de superficie de las SM en estudio se obtuvo de los experimentos realizados en monocapas de Langmuir. Analizando los valores de la presión de superficie (π) y el potencial de superficie (ΔV), así como los datos de la microscopía de ángulo de Brewster (BAM) en función de la compresión aplicada, se caracterizaron las interacciones intermoleculares durante el empaquetamiento de los lípidos y los cambios termodinámicos implicados en ellas. Las SM con VLCPUFA formaron films con un espesor considerablemente menor al esperado, encontrándose en un régimen líquido-expandido (LE) con una alta libertad conformacional. Sus valores de área molecular media (MMA) fueron llamativamente grandes con respecto a la de las SM conocidas, lo cual indica que un mismo número de moléculas ocupa un área significativamente mayor en la membrana. Las h-V SM mostraron menores MMA que las equivalentes n-V SM, confirmando que el grupo hidroxilo en las primeras favorece las interacciones intermoleculares, permitiendo así un mayor grado de empaquetamiento durante el proceso de compresión, lo que explica que ocupen una menor área en el plano de la membrana. Cuando se obtuvieron las isotermas a 7 °C de las seis especies de SM en estudio, sólo n-32:5 SM y h-32:5 SM mostraron transiciones de fase LE → LC (líquido condensado) de primer orden, otro hallazgo consistente con el comportamiento previamente observado en bicapa. Las seis especies moleculares mayoritarias de Cer con VLCPUFA también fueron separadas y estudiadas en monocapas de Langmuir. Las isotermas de compresión presentaron una transición de fase LE  LC de primer orden a temperatura ambiente, con segregación de dominios durante esta transición que pudo ser seguida mediante BAM. En ambos estados de fase, todas ellas mostraron valores mucho más altos de MMA y ΔV que las especies conocidas usadas como referencia. El empaquetamiento molecular y el grado de ordenamiento de las cadenas fue relativamente menor para las n-V Cer que para las h-V Cer. Estas últimas formaron membranas de mayor espesor, ocuparon una menor área de superficie, y presentaron transiciones de fase LE  LC más pronunciadas y cooperativas que las n-V Cer. Tomados en conjunto, los parámetros termodinámicos y de superficie permiten concluir que estas Cer se organizan con sus ácidos grasos en una conformación curvada, formando monocapas con un espesor menor al esperado, siendo esta característica aún más marcada en las n-V Cer que en las h-V Cer. Mientras las propiedades reológicas de la h-28:4 SM fueron similares a las de otras especies de SM, las de la h-28:4 Cer fueron atípicas. Así, la fase LC de ésta fue altamente compresible, lo que es consistente con una gran libertad conformacional de sus cadenas hidrofóbicas, pero la difusión en ella, estuvo muy restringida, presentando un coeficiente de difusión (D) 100 veces más bajo que su contraparte h-28:4 SM. Las propiedades de mezclas en que coexisten h-28:4 SM y h-28:4 Cer fueron estudiadas mediante la pre-mezcla de distintas proporciones de ambas y mediante la generación de la última por acción de una esfingomielinasa colocada en la subfase de un film de h-28:4 SM. Ambos enfoques evidenciaron que la Cer tiende a separarse de la fase fluida en que se encuentra la SM, formando dominios ricos en Cer a medida que aumenta la relación molar Cer/SM. A temperatura fisiológica, estos dominios mostraron una morfología y una organización estructural sobre la superficie del film que difirieron marcadamente de los que exhibió la 16:0 Cer. Tomadas en conjunto, las presentes observaciones podrían ser relevantes para la reorganización estructural que se sabe ocurre sobre la cabeza espermática durante la reacción acrosomal, al completarse la cual la mayor parte de las SM con VLCPUFA preexistentes se convierten en las correspondientes Cer.

The sphingolipids of mammalian germ cells and spermatozoa are unique in that they are made up by a high proportion of very long chain polyunsaturated fatty acids (VLCPUFA). In the rat gametes, sphingomyelin (SM) and ceramide (Cer) contain species with tetraenoic and pentaenoic fatty acids of the n-6 series with up to 32 carbon atoms, in non-hydroxylated (n-V) and 2-hydroxylated (h-V) forms. Previous studies had shown that the SM with VLCPUFA are formed in spermatogenic cells, that the ratio between h-V SM and n-V SM increases with germ cell differentiation, and that both up localized specifically on the sperm heads. Then it was seen that these SM decrease as Cer increase in rat gametes during reactions that take place in key stages of fertilization, especially during the acrosomal reaction. The aim of this work was to contribute to the knowledge of the biophysical properties of these unusual sphingolipids and to determine how such properties change as a result of these biochemical events. Our first challenge was to obtain these relatively minor molecular species in sufficient amounts and with acceptable purity. To this aim we took advantage of their chemical structure. Thus, fractions containing n-V SM and h-V SM species were separated from the major saturated and monoenoic SM taking into account the high number of double bonds of their fatty acids. Then, SM species containing n-28:4, n-30:5 and n-32:5 from the first fraction, and SM species with h-28:4, h-30:5 and h-32:5 from the second one, were obtained by making use of the differences in hydrophobicity among their fatty acids. These fractions and species were included in bilayer and monolayer model systems and studied by applying methodologies and instrumentation previously validated for SM species with 16:0, 18:1 and 24:1. A similar approach was applied to study the species in the n-V Cer and h-V Cer fractions. When studied by fluorescence spectroscopy, both the generalized polarization (GP) of Laurdan and the fluorescence anisotropy (r) of DPH showed that most of the n-V SM and h-V SM shared the characteristic of having very low transition temperatures (Tt), both below 5 °C, except n-32:5 SM and h-32:5 SM, whose Tt values were around 22 °C . The increase in Tt that could have been expected to result from the unusual length of the acyl chains is thus counteracted by the presence of several double bonds in these fatty acids. These studies indicated that the acyl chains of these species are in a disordered state at physiological temperature. The h-V SM exhibited higher GP and r values than the corresponding n-V SM species, indicating that the hydroxyl group in the former tends to promote intermolecular interactions, probably through the formation of hydrogen-bond type of unions. The interactions between SM with VLCPUFA and other lipids were investigated by employing multicomponent lipid systems in bilayer form. In bilayers formed by dimiristoyl-PC and these SM, it was concluded that the latter played the role of “fluidifying” lipids, in discrepancy to the generally accepted notion that in cell membranes the SMs are lipids that restrict the mobility of other lipids. In systems containing dioleoyl-PC, cholesterol and n-V SM or h-V SM, neither of these tended to segregate in SM/cholesterol-rich domains at room temperature, as clearly did 16:0 SM. Both experimental strategies suggested that at physiological temperature and in natural membranes were VLCPUFA-containing SM coexist with other lipids, as is the case of the plasma membrane of the sperm head, these species would not concentrate in cholesterol-rich membrane areas, but in areas rich in polyunsaturated fatty acids, namely in more “disordered” domains of the membrane. Valuable information about the surface properties of the SM under study was obtained from the experiments performed in Langmuir monolayers. By analyzing the values of surface pressure (π) and surface potential (ΔV), and the data from Brewster angle microscopy (BAM) as a function of the compression applied, the intermolecular interactions during the lipid packing and the thermodynamic changes implied in these interactions were characterized. The VLCPUFA-containing SM formed films with a considerably smaller thickness than that expected, and they were found in a liquid-expanded (LE) state with a high conformational freedom. The values of their mean molecular areas (MMA) were markedly high compared with those of best-known SM species, indicating that the same number of molecules occupies an area significantly larger in the membrane. The h-V SM species displayed lower MMA values than the equivalent n-V SM, confirming that the hydroxyl group in the former facilitates intermolecular interactions, thereby allowing a higher degree of packing during the compression process, and explaining that they occupy a smaller area in the plane of the membrane. When the isotherms of the six SM under study were obtained at 7 °C, only n-32:5 SM and h-32:5 SM exhibited first order LE → LC phase transitions, another finding consistent with the behavior previously observed in bilayer. The six major molecular species of Cer with VLCPUFA were also separated and studied in Langmuir monolayers. The compression isotherms showed that they underwent a first-order LE → LC (liquid condensed) phase transition at room temperature, the segregation of domains during that transition being clearly followed by means of BAM. In both phase states, all of them had MMA and ΔV values far higher than the Cer species used as reference. The molecular packing and degree of ordering of the chains were relatively lower for the n-V Cer than for the h-V Cer. The latter formed thicker films, occupied lower surface areas, and presented more pronounced and cooperative LE → LC phase transitions than the n-V Cer. Taken together, the thermodynamic and surface behavior parameters allow to conclude that these Cer species organize with their fatty acids in a curved conformation, forming monolayers with a lower than expected thickness, this feature being more marked for the n-V Cer than for the h-V Cer. Whereas the rheological properties of h-28:4 SM were similar to those of other SM species, those of h-28:4 Cer were atypical. Thus, the LC phase of the latter was highly compressible, in agreement with a high conformational freedom of their hydrophobic chains, but the diffusion in such phase was highly restricted, showing a diffusion coefficient (D) 100-fold lower than that of h-28:4 SM. The properties of mixtures in which h-28:4 SM and h-28:4 Cer coexist were studied by mixing them in different proportions and by generating the latter by the action of a sphingomyelinase placed in the subphase of an h-28:4 SM film. Both approaches evidenced that Cer tends to separate from the fluid phase of SM, forming Cer-rich domains as the molar Cer/SM ratio increases. At physiological temperature, these domains had a morphology and structural organization on the film surface that markedly differed from those displayed by 16:0 Cer. Taken together, the present observations could be relevant to the structural reorganization of the membrane that is known to take place on the sperm head during the acrosomal reaction, after the completion of which a major part of the preexisting VLCPUFA-rich SM are converted into the corresponding Cer.