Síntesis de nanopartículas magnéticas multifuncionales y sus aplicaciones en biomedicina

Abstract

El objetivo de esta Tesis es diseñar sistemas multifuncionales que combinen funciones de diagnóstico y terapia, o teranósticos, a base de nanopartículas magnéticas (NPMs) de óxido de hierro (magnetita/maghemita) para su potencial aplicación en patologías oncológicas. Para ello se realizó un trabajo experimental que involucró la optimización de las metodologías de síntesis de las NPMs y la posterior incorporación secuencial de los distintos componentes, en conjunto con las caracterizaciones y ensayos tendientes a evaluar su funcionalidad en cada etapa. En primer término, se estudiaron las vías de síntesis de NPMs de manera de conseguir un control sobre las propiedades fisicoquímicas, y de la estabilidad de NPMs en suspensión acuosa. Se modificó la superficie de las NPMs con ácido fólico (AF) de manera de proporcionar a las NPMs selectividad para acumularse en células tumorales debido a que el receptor de folatos se encuentra sobreexpresado en células de varios tipos de cáncer. En una etapa posterior, se cargaron las NPMs modificadas con AF con fármacos oncológicos para impartir la función terapéutica. La Doxorubicina (Doxo) es uno de los agentes quimioterapéuticos más efectivos usados en el tratamiento de varios tipos de cáncer. A pesar de su gran uso, varios efectos secundarios se encuentran asociados a la distribución sistémica de este fármaco una vez administrado. Estos efectos secundarios están relacionados con la necesidad de administrar dosis elevadas del fármaco debido a la escasa selectividad y eficacia asociada con su distribución no específica en el cuerpo. Las siguientes instancias del desarrollo de este trabajo de tesis se dedicaron a evaluar las potencialidades de los agentes teranósticos para: (i) direccionamiento mediado por un campo magnético; (ii) actuar como medio de contraste en diagnóstico por imagen mediante resonancia magnética (RMI), (iii) ejercer su acción terapéutica. En el Capítulo I se introducen los conceptos básicos sobre nanotecnología, nanociencia y nanomateriales. Se describen en mayor detalle las razones por las cuales se seleccionaron las NPMs para el desarrollo de este trabajo de tesis. Dentro del conjunto de NPMs se puntualiza en las de óxido de hierro, en particular, magnetita (MAG, Fe3O4). Los métodos de síntesis de este óxido de hierro son brevemente reseñados, profundizando en la técnica de co-precipitación. Además se describen las diferentes estrategias de estabilización y funcionalización del núcleo magnético. Se resumen las aplicaciones de las NPMs en biomedicina. En este sentido, se describen las ventajas de las mismas como herramientas de diagnóstico, al actuar como agentes de contraste en RMI. También se muestran las formas de vectorización de fármacos mediante el empleo de NPMs y se enuncian las habilidades de las nanoformulaciones descriptas para actuar como agentes teranósticos. Finalmente se enumeran el objetivo general y los objetivos específicos, así como la hipótesis planteada en esta tesis. En el Capítulo II se describen los reactivos empleados y las técnicas de caracterización aplicadas a las diferentes nanoformulaciones junto con el tratamiento necesario de las muestras en cada caso. El Capítulo III se dedicó al estudio de las metodologías de síntesis, estabilización y control de la estabilidad de las NPMs de MAG. Se describen los resultados obtenidos al emplear dos métodos de síntesis: co-precipitación y su variante reducción-precipitación, con el fin de seleccionar una metodología adecuada para la obtención de NPMs de MAG en función de las aplicaciones propuestas. En base a los resultados, se seleccionó la técnica de co-precipitación como la más adecuada, y se incluyó un estudio exhaustivo de las variables experimentales asociadas a dicha técnica con el propósito de conseguir un control de las propiedades fisicoquímicas. Este análisis involucró el estudio de los mecanismos que conducen a la formación de las NPMs de MAG así como una completa caracterización y los ensayos necesarios para evaluar la estabilidad, en términos de la evolución del diámetro hidrodinámico (DH) en función del tiempo de almacenamiento en suspensión acuosa. En el Anexo I se informan los resultados que complementan a este capítulo. En el Capítulo IV se estudió la incorporación de un ligando selectivo, la vitamina B9 ó AF, a la superficie de MAG, previamente funcionalizada con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTS). Para ello se evaluaron dos metodologías: la adsorción simple del AF y el anclaje covalente mediado por carbodiimida. Se combinaron los datos experimentales obtenidos con estudios teóricos. Esto permitió adquirir conocimientos acerca del mecanismo de interacción AF-MAG@APTS y corroborar la disponibilidad del grupo selectivo del AF posterior a su incorporación a la superficie de MAG@APTS. En una segunda instancia, se estudió la estabilidad de las nanoformulaciones obtenidas de acuerdo a dos criterios: (i) evolución del DH en función del tiempo de almacenamiento en dispersión acuosa y (ii) estudio de la capacidad de retención del AF incorporado. Finalmente, se incluye un estudio tendiente a predecir el comportamiento de las nanoformulaciones en un medio que simula el plasma sanguíneo en términos de osmolaridad, pH y contenido de proteína. En el Capítulo V se presentan y discuten los ensayos realizados para proveer a las nanoformulaciones de la acción terapéutica necesaria para constituir un agente teranóstico. La carga de la droga se realizó mediante adsorción superficial, explorando la influencia de diferentes parámetros asociados a dicho procedimiento. Se evaluó la liberación de Doxo in vitro mediante la implementación de una metodología que intenta simular la ruta que debería atravesar la nanoformulación una vez inyectada, vía intravenosa, en el torrente sanguíneo hasta su acumulación en el tumor. En el Capítulo VI se investigó la habilidad de las NPMs, presentadas en los Capítulos IV y V, para ser guiadas magnéticamente al exponerlas a un campo magnético externo mediante ensayos in vitro. Se propuso el empleo de un sistema de flujo continuo acoplado a un espectrofotómetro Uv-Visible, con el objetivo de monitorear la disminución del contenido de NPMs de la dispersión estudiada como consecuencia de la retención de las mismas por acción de un imán de NdFeB colocado en el sitio blanco. En este capítulo, se analizó además, la capacidad de las nanoformulaciones como agentes de contraste. Se determinó la eficiencia de contraste de cada formulación, comparando los valores obtenidos con los correspondientes a agentes de contrastes comerciales. En el Capítulo VII se incluyen ensayos in vitro, empleando una línea celular de cáncer colorrectal (CCR), con el fin de evaluar la capacidad del nanoteranóstico preparado de inhibir el crecimiento celular, a través de la internalización y la posterior liberación de droga en forma intracelular. En este mismo capítulo, se presentan, como complemento, los resultados correspondientes al estudio de la biocompatibilidad de las mismas nanoformulaciones utilizando un modelo animal de zebrafish. En el Anexo II se informan los resultados que complementan a este capítulo. Finalmente, en el Capítulo VIII, se puntualizan las conclusiones generales abordadas a partir de los resultados obtenidos y analizados en cada uno de los capítulos. Se definen además, los lineamientos de la proyección de futuros trabajos.

The aim of this thesis is to design multifunctional nanosystems combining the diagnostic and therapy or theranostics, based on magnetic nanoparticles (MNPs) of iron oxide (magnetite/maghemite) for their potential application in the treatment of oncological pathologies. To this end, an experimental work involving the optimization of MNPs synthetic procedures followed by a sequential incorporation of different components was performed. The synthesis of MNPs was carefully studied in order to achieve a control on their physicochemical properties and stability in aqueous suspension. The folate receptor is overexpressed in several types of tumor cells. Therefore, MNPs surface was modified with folic acid (FA) to provide them selectivity and affinity towards tumor cells. At a later stage, MNPs modified with FA were loaded with an oncological drug aiming to impart them therapeutic function. Doxorubicin (Doxo) is one of the most effective and used chemotherapeutic agents for the treatment of many types of cancer. In spite of this, several side effects are associated with the systemic distribution of this drug once administrated. These unwanted effects are related to large drug dosage, poor selectivity and low efficiency associated to the non specific distribution of drugs in the body. The following instances comprising this work were devoted to evaluate the capabilities of the theranostic agents concerning: (i) in vitro magnetic targeting, (ii) diagnostic as contrast agent for imaging magnetic resonance (MRI); (iii) therapeutic functions. In Chapter I, the fundamental concepts regarding the nanotechnology, nanoscience and nanomaterials are introduced. The abilities of MNPs to these kinds of applications are emphasized, justifying their selection for the development of this thesis. Magnetite (MAG, Fe3O4) was employed to formulate the MNPs. The methods of synthesis are briefly reviewed, highlighting the co-precipitation technique. Besides, different stabilization and functionalization strategies of the magnetic core are described. The applications of MNPs in biomedicine are summarized. Their capabilities as contrast agents in RMI, and target drug delivery are presented, as well as their potential as theranostic agents. Finally, the hypothesis followed by the general and specific objectives is defined. Chapter II describes all reagents and solvents employed in this work. Besides, the techniques used for the nanoparticles characterizations are described together with preparative treatment of the samples for each one. In Chapter III, the study of the synthesis methodologies, and stabilization of MAG are presented. Two methods of obtention are described; co-precipitation and its reduction-precipitation, both were evaluated in order to select a suitable methodology for achieving MAG. The co-precipitation technique was chosen based on the reached results. An exhaustive study of the experimental conditions associated to this methodology was included. This analysis involved the study of MAG formation mechanisms as well as a complete structural and surface characterization. The necessary tests to evaluate the stability, in terms of the evolution of the hydrodynamic diameter (HD) as a function of the storage time in aqueous suspension were performed. Complementary results are reported in Annex I. In Chapter IV the incorporation of FA to MAG surface, previously modified with APTS, was studied aiming to provide selectivity towards folate receptors. To do this, two methodologies were evaluated: simple adsorption and covalent linkage. The obtained experimental data were combined with theoretical studies to gain knowledge about the possible mechanisms to FA-MAG@APTS linkage. These data also provided evidence regarding the availability of the selective FA group after its incorporation into the MAG@APTS surface. The stability of the obtained nanoformulations was studied based on two criteria: (i) the evolution of the HD as a function of the storage time in aqueous dispersion and (ii) the study of the FA retention. Finally, a study tending to predict the behavior of nanoformulations in a medium simulating blood plasma in terms of osmolarity, pH and albumin content was developed. In this sense, the aggregation trend and the nanosystems stability were the analyzed parameters. In Chapter V, the assays devoted to provide the nanoformulations with therapeutic action are presented and discussed. The loading of the drug (Doxo) was carried out by simple adsorption. The influence of different parameters associated with the reaction was explored. The release of Doxo was analyzed by implementing an original procedure to simulate the pathways followed by MNPs once intravenously administered. In Chapter VI, the magnetic target ability of MNPs presented in Chapters IV and V, was in vitro investigated. To achieve this, a novel continuous flow system was fabricated to quantify the amount of MNPs retained in the magnet site in an environment mimicking the bloodstream. On the other hand, the efficiency of the nanosystems as selective contrast agents in MRI was analyzed using a clinical equipment. Chapter VII includes in vitro tests, using a human colorectal cancer cell line (CCR). The evaluated parameters were the MNPs internalization, cellular viability and the therapeutic action of the MNPs loaded Doxo. On the other hand, the results corresponding to biocompatibility studies of the same nanoformulations in vivo are presented. To this end an animal model, zebrafish (Danio rerio), was implemented. Complementary results are reported in Annex II. Finally, Chapter VIII lists the overall conclusions of this investigation work and establishes the guidelines for the future works.