Rol de la testosterona y su receptor frente a la apoptosis en células musculares esqueléticas murinas

Abstract

La pérdida de masa y fuerza del músculo esquelético, característico de ciertas miopatías como la sarcopenia, es una condición frecuente durante el envejecimiento, y está asociada a disfunciones de los sistemas muscular y esquelético. Aunque los mecanismos moleculares involucrados en esta patología no están totalmente esclarecidos, existen evidencias que demuestran que la apoptosis es en parte responsable de la pérdida de miocitos en la adultez, contribuyendo a la patogénesis de la sarcopenia. Puesto que los niveles de hormonas sexuales disminuyen con la edad, la sarcopenia se ha asociado al déficit de las mismas. En este trabajo, se ha demostrado que la testosterona, a concentración fisiológica, protege frente a la apoptosis inducida por H2O2 en la línea celular de músculo esquelético murino C2C12. Las alteraciones morfológicas típicas de la apoptosis tales como fragmentación nuclear, desorganización del citoesqueleto, reorganización/disfunción mitocondrial y liberación de citocromo c inducidos por el H2O2, son inhibidas cuando las células son previamente tratadas con la hormona. Se ha observado que las células C2C12 muestran una respuesta bifásica en presencia del agente apoptótico. A tiempos cortos de exposición al H2O2, las células activan un mecanismo de defensa, para evitar entrar en apoptosis, el cual consiste en la fosforilación de ERK2, Akt y Bad y en un aumento de expresión de la proteína asociada a eventos de supervivencia, HSP70. Simultáneamente y a partir de aproximadamente media hora de tratamiento con H2O2, se observa la fosforilación de JNK, p66Shc y p53, estas últimas mostrando un pico máximo de activación a la 1-2 hs. A tiempos más largos de exposición al agente apoptótico (4 hs) se produce la defosforilación de ERK2, Akt y Bad, se mantiene la fosforilación de JNK, disminuye la activación de p53 y p66Shc, se produce la liberación de citocromo c, el clivaje de PARP, la fragmentación del ADN y la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, indicando que las células inician finalmente el proceso de muerte celular programada. Sin embargo, cuando las células son tratadas con testosterona, previo a la exposición al H2O2, se reduce la fosforilación de JNK, se observa la inactivación de la proteína apoptótica Bad, disminución de los niveles de la proteína apoptótica Bax, inhibición del clivaje de PARP, prevención de la pérdida del potencial de membrana mitocondrial y disminución de la fosforilación y localización mitocondrial de la proteína amplificadora del estrés oxidativo, p66Shc. El empleo de un antagonista no esteroideo específico para la testosterona, la Flutamida, reduce el efecto protectivo del esteroide, involucrando al receptor de andrógenos (AR) en los efectos antiapoptóticos de la hormona. También, se obtuvieron evidencias bioquímicas, farmacológicas e inmunológicas, que demuestran la presencia del AR con localización clásica (nuclear) y no clásica en microdominios (específicamente caveolas y rafts) y mitocondrias. Las distintas localizaciones del AR podrían mediar el efecto antiapoptótico de la testosterona a distintos niveles subcelulares. Los resultados aquí presentados permiten comenzar a definir y esclarecer los mecanismos de señalización activados por la testosterona y su receptor, que median el efecto protectivo frente al daño oxidativo en músculo esquelético y su relación con miopatías asociadas al déficit de hormonas sexuales.

The loss of muscle mass and strength with aging, also referred to as sarcopenia, is a highly prevalent condition among the elderly, and it is associated with skeletal mechanisms underlying accumulating evidence muscle dysfunction. sarcopenia suggests are that far an Although from age-related the being exact clarified, acceleration of myocyte loss via apoptosis might represent a key mechanism responsible for impairment of muscle performance. Sarcopenia has been associated with a deficit of sex hormones as the levels of estrogens and/or testosterone decline with aging. In this work, it has been demonstrated that, at physiological concentrations, testosterone protects against H2O2- induced apoptosis in C2C12 muscle cells. Typical changes of apoptosis such as nuclear fragmentation, cytoskeleton disorganization, mitochondrial reorganization/dysfunction and cytochrome c release induced by H2O2, are abolished when cells are previously exposed to the hormone. It has been observed that C2C12 cells show a biphasic response when they are treated with the apoptotic agent. At short times of exposure to H2O2, C2C12 cells exhibit a defense response showing ERK2, Akt and Bad phosphorylation and an increase of HSP70 levels. Simultaneously and approximately after half an hour from the beginning of H2O2 treatment, JNK, p53 and p66Shc phosphorylation are observed, with maximum activation for p53 and p66Shc after 1-2 hours. At longer treatment times (4hs), dephosphorylation of ERK2, Akt and Bad is observed, JNK continues phosphorylated, the activation of p53 and p66Shc decreases and cytochrome c release, PARP cleavage, DNA fragmentation and the loss of mitochondrial membrane potential occur, indicating that cells finally enter into apoptosis. However, incubation with testosterone prior to H2O2, reduces JNK phosphorylation, induces Bad inactivation, inhibition of PARP cleavage, a decrease in Bax levels; reduces the loss of mitochondrial membrane potential and p66Shc phosphorylation and its mitochondrial localization. The employment of the androgen receptor (AR) antagonist, Flutamide, decreases the protective effects of the hormone, pointing to a possible participation of the AR in the anti-apoptotic effect of testosterone. Moreover, biochemical, pharmacological and immunological data demonstrate a classical (nuclear) and non-classical localization of the AR in microdomains (caveolae and rafts) and mitochondria. These results assign an active role for the AR during the anti-apoptotic effect of the hormone, possibly, at different subcellular levels. The data presented in this work unravel in part the molecular mechanisms activated by testosterone and its receptor, underlying the survival action of the hormone against oxidative stress damage in skeletal muscle and its relationship with myopathies associated with sex hormonal dysregulation.