Estudio de la apoptosis y autofagia como parte del mecanismo antineoplásico de la vitamina D en el sarcoma de Kaposi

Abstract

El herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, KSHV, es el agente etiológico del sarcoma de Kaposi. Dentro del genoma viral, el receptor viral acoplado a proteína G (vGPCR) conduce a la oncogénesis y angiogénesis; su expresión persistente y actividad es necesaria para el mantenimiento del tumor. La forma hormonal activa de la vitamina D, 1α,25(OH)2D3, presenta efectos antineoplásicos en varios tipos de tumores. El potencial anti-proliferativo y antiinflamatorio del 1α,25(OH)2D3 en células endoteliales que expresan el vGPCR ha sido explorado por nuestro grupo. En los últimos años se ha incrementado el uso de análogos sintéticos del 1α,25(OH)2D3 con menor actividad calcemica para minimizar la hipercalcemia producida por dosis altas del metabolito. En este trabajo de Tesis Doctoral se profundizó en el mecanismo de acción antineoplásico del 1α,25(OH)2D3 y su análogo menos calcemiante TX 527. Se obtuvo evidencia que ambos compuestos promueven la apoptosis a través de un desbalance entre los miembros de la familia de proteínas Bcl-2 en células vGPCR. Se observó un aumento en los niveles de expresión de la proteína pro-apoptótica BIM y disminución de A20 por un mecanismo dependiente del VDR y un pico de inactivación en la fosforilación de BAD acompañado por la formación de complejos con Bcl-2, alterando posiblemente la integridad de la mitocondria. También, se demostró que el 1α,25(OH)2D3 y TX 527 inducen autofagia a través de la inactivación del eje PI3K/Akt/mTOR y regulación de BECN1 como parte del mecanismo antineoplásico de acción. Asimismo, ambos agonistas regulan la proliferación de las células vGPCR mediante la inactivación de ERK1/2 y p38 y aumento de la expresión de las fosfatasas MKP-3 y MKP-5. Eventos regulados por la expresión del VDR, con excepción de ERK1/2, debido probablemente a una regulación no genómica de esta quinasa. El Bortezomib, inhibidor del proteasoma y de la activación de NF-ĸB, disminuyó la proliferación celular e indujo apoptosis por un mecanismo similar a los agonistas del VDR en células vGPCR. Proceso acompañado además por la activación del factor de transcripción FOXO1, disminución en la expresión génica de VEGF y aumento del inhibidor del ciclo celular, p21. Debido a las limitaciones que presentan los cultivos celulares bidimensionales, se desarrolló un método para obtener esferoides multicelulares a partir de células endoteliales y transformadas por la expresión del vGPCR. Las células vGPCR cultivadas en una superficie de baja adherencia desarrollaron esferoides de mayor tamaño y el tratamiento con 1α,25(OH)2D3 produjo cambios morfológicos con la consecuente inducción de apoptosis. A nivel molecular, se observó un aumento en la expresión génica del VDR, BIM y p21 al aumentar la dosis. Además, el 1α,25(OH)2D3 provocó un aumento en los niveles proteicos de BIM y disminuyó la activación de ERK1/2 y Akt, permitiendo concluir que las células en cultivos tridimensionales responden al agonista de manera similar a lo observado en cultivos en monocapa. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis contribuyen al conocimiento del mecanismo de acción antiproliferativo del 1α,25(OH)2D3 y su análogo menos calcemiante TX 527 en un modelo celular de sarcoma de Kaposi. A su vez, sustenta las bases para dar continuación a otros estudios en modelos in vivo y evaluar su potencial aplicación, sólo o en combinación con Bortezomib, en el tratamiento de esta patología.

The Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, KSHV, is the etiological agent of Kaposi's sarcoma. Within the viral genome, the viral G protein-coupled receptor (vGPCR) leads to oncogenesis and angiogenesis; its persistent expression and activity are necessary for tumor maintenance. The active hormonal form of vitamin D, 1α,25(OH)2D3, has antineoplastic effects in several types of tumors. The anti-proliferative and antiinflammatory potential of 1α,25(OH)2D3 in endothelial cells expressing vGPCR has been explored by our group. In recent years, the use of synthetic analogues of 1α,25(OH)2D3 with lower calcemic activity has been increased to minimize the hypercalcemia produced by high doses of the metabolite. In this Doctoral Thesis work, the antineoplastic mechanism of action of 1α,25(OH)2D3 and its less calcemic analogue TX 527 was studied. Evidence was obtained that both compounds promote apoptosis through an imbalance of Bcl-2 protein family members in vGPCR cells. An increase of pro-apoptotic BIM and a decrease of A20 protein expression levels by a VDRdependent mechanism was observed, as well as, a peak of inactivation of phosphorylated BAD accompanied by its association with Bcl-2, possibly altering mitochondria integrity. It was also demonstrated that 1α,25(OH)2D3 and TX 527 induce autophagy through the inactivation of the PI3K/Akt/mTOR axis and regulation of BECN1 as part of the antineoplastic mechanism of action. Moreover, both agonists regulate vGPCR cells proliferation by inactivating ERK1/2 and p38 and increasing MKP- 3 and MKP-5 phosphatases expression. These events were regulated by VDR expression, with the exception of ERK1/2, probably due to a non-genomic regulation of this kinase. Bortezomib, an inhibitor of proteasome and NF-ĸB activation, decreased cell proliferation and induced apoptosis by a similar mechanism to VDR agonists in vGPCR cells. Process also accompanied by the activation of the transcription factor FOXO1, decrease in VEGF gene expression and increase of the cell cycle inhibitor, p21. Due to the limitations of two-dimensional cell cultures, a method was developed to obtain multicellular spheroids from endothelial cells and transformed by the expression of vGPCR. vGPCR cells cultured on a low adhesion surface developed larger spheroids and treatment with 1α,25(OH)2D3 triggered morphological changes with consequent apoptosis induction. At molecular level, an increase in VDR, BIM and p21 gene expression was observed when dose was increased. In addition, 1α,25(OH)2D3 caused an increase in BIM protein levels and decreased the activation of ERK1/2 and Akt, allowing to conclude that cells in three-dimensional cultures respond to the agonist in a similar way to that observed in monolayer cultures. The results obtained in this thesis work contribute to the knowledge of the anti-proliferative mechanism of action of 1α,25(OH)2D3 and its less calcemic analogue TX 527 in a cellular model of Kaposi's sarcoma. In turn, it supports the bases to continue other studies in vivo models and evaluate their potential application, either alone or in combination with Bortezomib, in the treatment of this pathology.