Efectos del calcitriol en células de músculo esquelético normal y de rabdomiosarcoma

Abstract

El metabolito activo de la vitamina D es el calcitriol o 1α,25(OH)2 vitamina D3 (1,25D). El 1,25D ingresa a la célula difundiendo a través de la membrana plasmática y se une a su receptor, el receptor de la vitamina D (VDR). Este complejo desencadena acciones rápidas, no genómicos (como la activación de vías de señalización MAPKs, y la generación de segundos mensajeros, como el aumento del Ca2+ intracelular) o efectos genómicos que requieren generación de nuevas proteínas. Dado que la mayor parte de los efectos del 1,25D reportados involucran al VDR y éste se expresa en la mayoría de los tejidos, esta hormona esteroide se considera pleiotrópica. En el laboratorio donde trabajo, se ha demostrado que el VDR se expresa en el músculo esquelético y que el tratamiento con 1,25D (10-9 M) es capaz de promover a proliferación y la activación de vías de señalización como las MAPKs, Akt, con la participación de Src, muy rápidamente, tanto en mioblastos proliferativos como en miotubos diferenciados. Por otro lado está ampliamente documentado que el 1,25D tiene efectos anti-proliferativos y pro-apoptóticos en varios tipos de cáncer. En este trabajo de Tesis Doctoral, se evidenció que en la línea de músculo esquelético normal C2C12, durante la fase proliferativa, el tratamiento con 1,25D (10-9 M) promueve la expresión del VDR y la activación de p38 MAPK y ERK 1/2, que promueven la expresión de las CDK 4/6. Más tarde, durante el arresto promotor de diferenciación, iniciado por el 1,25D, la expresión del VDR y la activación de la p38 MAPK son esenciales para inducir el aumento en la expresión de la ciclina D3, de los CKIs p21Cip1/WAF1 y p27Kip1, y del marcador de diferenciación muscular miogenina, el cual también requiere que la ciclina D3 se exprese. En las células C2C12 que están en la etapa de diferenciación temprana, en la fase de alineación (previo a la fusión celular para la formación del miotubo), la hormona esteroide 1,25D unida a su receptor tiene la capacidad de activar la tirosina quinasa no receptora Src y las MAPKs ERK 1/2 y p38 MAPK, a tiempos cortos (hasta de una hora), sin embargo no es capaz de modificar la expresión de proteínas (como las ciclinas D1 y D3 o la caveolin-1). El rabdomiosarcoma (RMS) es el cáncer de tejido blando más común entre los niños y tiene características de músculo esquelético, a pesar de tener múltiples orígenes. La línea RD es una línea celular de rabdomiosarcoma humano, originada de biopsias de una paciente caucásica de siete años de edad. A pesar de la evidencia acumulada de los efectos antineoplásicos de la hormona esteroide 1,25D, en diferentes tipos de cáncer, solo existe un reporte de los efectos de este esteroide en RMS, en líneas diferentes a la línea RD. En esta Tesis Doctoral, se evidenció que las células RD expresan basalmente VDR y que el tratamiento con la hormona durante 24 y 48 horas promueve un incremento de este receptor. Además el 1,25D (10-9 M) promueve la activación de p38 MAPK, vía su quinasa upstream inmediata MKK 3/6 y Src a tiempos cortos en las células RD. De relevancia, se observó que la activación de p38 MAPK es necesaria para la activación de Src, pese a ser esta una quinasa upstream de las MAPKs. El tratamiento con 1,25D durante 72 horas provoca una marcada disminución en la expresión del VDR junto con una inhibición en la proliferación (ya que decrece la cantidad de células vivas y aumenta la expresión de p15INK4). Conjuntamente, la hormona no promueve la diferenciación celular (ya que no se observan cambios morfológicos y disminuye la expresión de marcadores de diferenciación tempranos) y estimula la apoptosis (aumentando la expresión de los mediadores ciclina D1 y CDK4 y causando picnosis mitocondrial y pérdida de la red mitocondrial). En conclusión, el metabolito activo de la vitamina D, el calcitriol tiene efectos opuestos en el músculo esquelético normal y el transformado, ya que en el primero promueve la proliferación seguida de un arresto pro-diferenciativo, mientras que en RMS es capaz de inducir la apoptosis.

The vitamin D active metabolite is the calcitriol or 1α,25(OH)2-vitamin D3 (1,25D). The 1,25D diffuse into the cell through the plasmatic membrane and it binds to its receptor, the vitamin D receptor (VDR). This complex triggers non-genomic, rapid actions (like activation of MAPKs pathways, and second messengers, like intracellular Ca2+ increase) or genomic effects that require protein synthesis. Almost all of the 1,25D actions require the VDR, and this receptor is expressed in almost all tissues, this steroid hormone is pleiotropic. In the laboratory where I investigate, it was demonstrated that the VDR is expressed in skeletal muscle and 1,25D treatment promotes proliferation and activation of MAPK, Akt, and the tyrosine kinase Src, quickly, in both proliferating myoblast and differentiated myotubes. By another hand, it was largely reported that 1,25D exerts antiproliferative and proapoptotic effects in many different cancer types. In this Ph.D. Thesis, it was evidenced that in normal skeletal muscle cell line C2C12, in the proliferative state, 1,25D (10-9 M) treatment promotes VDR expression and p38 MAPK and ERK 1/2 pathways activation, and all these together induce CDK 4/6 expression. Then, during pro-differentiative arrest induced by 1,25D, the VDR expression, and p38 MAPK activation are key events to promote an increase in Cyclin D3, CKIs p21cip1/WAF1 and p27kip1 and myogenin expression. In C2C12 cell, in an early differentiation state, during myoblast alignment, 1,25D through its receptor induce Src, ERK 1/2 and p38 MAPK pathways activation, within a few minutes, but this short treatment cannot modify some proteins expression involved in differentiation process (like Cyclin D3 and D1, or caveolin-1). Rhabdomyosarcoma (RMS) is the soft tissue cancer most common in children with skeletal muscle features, although it has different origins. The RD cell line is a human RMS cell line, originated from biopsies from a seven years old Caucasian patient. There is accumulated evidence about antineoplastic effects of 1,25D, in different cancer types; nevertheless, there is only one report relative to the effects of this steroid hormone treatment developed in RMS cell lines different to RD. In this PhD. Thesis, it was shown that RD cells express basally VDR and hormone treatment during 24 and 48 hours promotes an increase of this receptor. Moreover, 1.25D (10-9 M) promotes p38 MAPK activation via its immediate upstream kinase, MKK 3/6, and Src at short times of steroid exposition. Of relevance, it was observed that p38 MAPK activation is necessary for the activity of Src, despite this being an upstream kinase of MAPKs. Treatment with 1.25D for 72 hours causes a decrease in VDR expression and the inhibition in proliferation (since it decreases the amount of living cells and increases the expression of p15INK4). This steroid treatment does not promote differentiation, since no morphological changes were observed and the expression of early differentiation markers falls. Furthermore, 1,25Dstimulates apoptosis increasing the expression of cyclin D1 and CDK4 mediators and causing mitochondria pyknosis and disruption of mitochondrial network). In conclusion, the active metabolite of vitamin D, calcitriol has opposite effects on normal and transformed skeletal muscle cells, since in the normal cells it promotes proliferation followed by a pro-differentiative arrest, whereas in RMS it is capable of inducing apoptosis.