Rol de los mecanismos de remodelación lipídica en modelos celulares de neurodegeneración

Abstract

La enfermedad de Parkinson (PD) es un desorden progresivo del movimiento y es la segunda enfermedad relacionada con la edad más común, luego de la enfermedad de Alzheimer. Se la considera como un desorden multifactorial y complejo que involucra tanto factores epidemiológicos como genéticos y toxicológicos, y cuya principal característica es la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas. A pesar de los recientes avances que intentan comprender las bases moleculares de esta patología, el mecanismo exacto que desencadena la degeneración de las neuronas dopaminérgicas todavía no se conoce. Numerosos estudios previos destacan dos características comunes de las lesiones de la substancia nigra pars compacta de los cerebros con PD: i) alteraciones en el contenido de los metales de transición y, en consecuencia, aumento del estrés oxidativo (OS) y ii) sobreexpresión y agregación patológica de la proteína α-sinucleína (α-sin). El desbalance en los niveles de los metales de transición ha sido reportado como uno de los principales factores que contribuyen a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la PD. Específicamente, se ha descripto que la sobrecarga de hierro (Fe) y la desregulación de los niveles de cobre (Cu) estarían involucradas en el daño de las neuronas dopaminérgicas en esta patología. En la primera parte de este trabajo de tesis, nuestro objetivo fue caracterizar los mecanismos de reparación de membrana mediante el estudio de las reacciones de acilación y deacilación y su rol en la injuria oxidativa en la neuronas dopaminérgicas N27 expuestas a sobrecarga de Fe y suplementación con Cu. Las neuronas N27 incubadas en presencia de Fe2+ (1 mM) por 24 hs mostraron elevados niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), peroxidación lipídica y aumentada permeabilidad de membrana plasmática. Por otro lado, en las neuronas que fueron suplementadas con Cu2+ (10,50 μM) no se observaron alteraciones en los marcadores de OS. Se observó un perfil de acilación diferencial en las neuronas N27 premarcadas con [3H]ácido araquidónico (AA) o [3H]ácido oleico (OA). En las neuronas expuestas a Fe2+, la incorporación de AA aumentó en la fracción de triacilglicéridos (TAG), mientras que su incorporación en la fracción de fosfolípidos (PL) se vio disminuida. El contenido de TAG resultó más elevado (40 %) en las neuronas expuestas a Fe2+ que en los controles. Este aumento fue acompañado por la aparición de cuerpos lipídicos Nile Red positivos. En contraposición, la incorporación de OA se vio incrementada en la fracción de PL y no mostró cambios en los TAG. El perfil de acilación lipídica en las neuronas que fueron suplementadas con Cu mostró una mayor acumulación de AA en el PL fosfatidilserina y ningún cambio con respecto a su incorporación en TAG. La inhibición de las reacciones de acilación/deacilación desencadenaron un aumento en los niveles de los marcadores de OS y disfuncionalidad mitocondrial en las neuronas expuestas a sobrecarga de Fe2+. Estos hallazgos brindan evidencia acerca de la participación de los mecanismos de acilación frente a la injuria oxidativa inducida por Fe2+ y postulan que las neuronas dopaminérgicas preservan, inteligentemente, el AA en los TAG en respuesta al OS. Como se mencionó anteriormente, la sobreexpresión patológica de la α-sin está involucrada en la muerte de las neuronas dopaminérgicas en la PD. En la segunda parte de este trabajo, caracterizamos el rol de dos variantes de la α-sin, WT (en su forma nativa) y A53T (una mutación que se encuentra en la PD familiar de aparición temprana), durante el OS inducido por Fe2+ y estudiamos como el metabolismo lipídico estaría involucrado en el destino neuronal. Para ello, utilizamos la línea celular neuronal dopaminérgica N27 sin transfectar (UT) y dos líneas celulares N27 transfectadas de forma estable con WT-α-sin (WT) o A53T-α-sin (A53T). Estas células fueron expuestas a daño inducido por Fe2+ y luego, se analizaron los marcadores de OS y el estado del metabolismo lipídico. Dependiendo del tipo de α-sin expresado, se obtuvieron distintas respuestas neuronales a la sobrecarga de Fe2+. Las células A53T expuestas a injuria inducida por Fe2+ mostraron menores niveles de ROS y menor alteración en la permeabilidad de la membrana plasmática respecto a las neuronas WT. La presencia de A53T-α-sin provocó un aumento en el contenido de TAG, el cual fue aún mayor luego de la exposición de las neuronas a sobrecarga de Fe2+. Por otro lado, las neuronas WT no mostraron alteraciones en el contenido de TAG, respecto a las células UT. Las neuronas A53T también presentaron un aumento en la expresión de la sintasa de ácidos grasos (FAS), junto con una mayor resistencia a la cerulenina, un potente inhibidor de la FAS. El contenido de PL y colesterol (Chol) fue similar en las neuronas UT, WT y A53T. La inhibición farmacológica de la síntesis de novo de los TAG provocó un aumento en la muerte celular de las células A53T durante el daño inducido por Fe2+ mientras que la inhibición de los mecanismos de acilación/deacilación no afectaron ni el contenido de TAG ni la viabilidad celular en la medida en que se afectaron estos parámetros en las células UT. Nuestros resultados brindan nueva evidencia acerca del rol diferencial de las variantes de α-sin en el metabolismo lipídico neuronal, que está relacionado a la respuesta neuronal a la sobrecarga de Fe2+. En conclusión, hemos demostrado que la respuesta neuronal al daño oxidativo y a la sobreexpresión de A53T-α-sin, es dependiente de los mecanismos de acilación/deacilación lipídica e involucra acumulación de TAG. Aunque la inhibición de la síntesis de TAG en las neuronas A53T promueva la muerte celular, nuestros resultados sugieren que la aparición de TAG, algo inusual para el fenotipo neuronal, podría constituir un marcador temprano de daño neuronal.

Parkinson’s disease (PD) is a progressive movement disorder and is the second most common age-related neurodegenerative illness after Alzheimer’s disease. PD is a multifactorial and complex disorder including epidemiological, genetic and toxicological factors whose main characteristic is the progressive loss of dopaminergic neurons. Despite all the effort to understand the molecular basis of this pathology, the exact molecular mechanism that triggers the degeneration of dopaminergic neurons remains still unknown. Cumulative evidence highlights two common facts that occur in the substantia nigra pars compacta lesions in the brain of PD patients: i) alterations in transition metal content and, in consequence, increased oxidative stress (OS) and ii) overexpression and pathological aggregation of the protein α-synuclein (α-syn). Metal-imbalance has been reported as one of the main contributing factor for the degeneration of dopaminergic neurons in PD. Specifically, iron (Fe) overload and copper (Cu) mis-compartmentalization have been reported to be involved in the injury of dopaminergic neurons in this pathology. In the first part of this work, our aim was to characterize the mechanisms of membrane repair by studying lipid acylation and deacylation reactions and their role in oxidative injury in N27 dopaminergic neurons exposed to Fe-overload and Cu-supplementation. N27 dopaminergic neurons incubated with Fe2+ (1 mM) for 24 hs displayed increased levels of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation and elevated plasma membrane permeability. Cu2+-supplemented neurons (10, 50 μM) showed no evidence of OS markers. A different lipid acylation profile was observed in N27 neurons pre-labeled with [3H]arachidonic acid (AA) or [3H]oleic acid (OA). In Fe-exposed neurons, AA uptake was increased in triacylglycerols (TAG) whereas its incorporation into the phospholipid (PL) fraction was diminished. TAG content was 40 % higher in Feexposed neurons than in controls. This increase was accompanied by the appearance of Nile red positive lipid bodies. Contrariwise, OA incorporation increased in the PL fractions and showed no changes in TAG. Lipid acylation profile in Cu-supplemented neurons showed AA accumulation into phosphatidylserine and no changes in TAG. The inhibition of deacylation/acylation reactions prompted an increase in OS markers and mitochondrial dysfunction in Fe-overloaded neurons. These findings provide evidence about the participation of lipid acylation mechanisms against Fe-induced oxidative injury and postulate that dopaminergic neurons cleverly preserve AA in TAG in response to OS. As previously mentioned, pathological α-syn overexpression is involved in the death of dopaminergic neurons in PD. In the second part of this work, we characterized the role of α-syn variants, Wild Type (WT) and A53T (a dominant mutation found in familial early onset PD) during Fe-induced OS and investigated whether lipid metabolism has implications for neuronal fate. To this end, we used the N27 dopaminergic neuronal cell line non-transfected (UT) and two stably transfected N27 cell lines with WT α-syn (WT) or mutated A53T α-syn (A53T). Cells were exposed to Fe-induced injury and OS markers and the status of lipid metabolism were analyzed. Neuronal response to Fe-induced overload is dependent on the type of α-syn expressed. A53T cells exposed to Fe-induced injury showed lower ROS levels and diminished plasma membrane permeability alteration than WT neurons. The presence of A53T α-syn promoted an increase in TAG content that was enhanced during Fe-induced OS. On the contrary, WT neurons did not display changes in TAG levels with respect to UT cells. A53T neurons also exhibited an increase in fatty acid synthase (FAS) expression, and higher resistance to the potent FAS inhibitor cerulenin. PL and cholesterol (Chol) content were similar in UT, WT and A53T neurons. Pharmacological inhibition of de novo synthesis of TAG increased A53T cell death during Fe-induced injury whereas the blockage of PL and Chol acylation/deacylation affected neither TAG content nor cell viability to the same extent as that observed in UT neurons. Our results bring new evidence about a differential role of α-syn variants on neuronal lipid metabolism that is related to the neuronal response to Fe-overload. In conclusion, we have demonstrated that the neuronal response to OS injury and A53T α-syn overexpression is dependent on lipid acylation and deacylation mechanisms and also involves TAG accumulation. Even though the inhibition of TAG synthesis in A53T neurons promoted cell death, our findings suggest that TAG appearance, rather unusual for the neuronal phenotype, could constitute an early marker of neuronal injury.