Caracterización de las vías de la fosfolipasa A_2 en procesos de neurodegeneración inducidos por estrés oxidativo en la retina bovina

Abstract

La acumulación de hierro (Fe) y el estrés oxidativo son eventos patognomónicos de las retinas de pacientes que padecen degeneración macular relacionada con la edad (AMD, del inglés age-related macular degeneration). En este trabajo de tesis hemos caracterizado un modelo de sobrecarga de Fe en retinas bovinas incubadas in vitro con la finalidad de estudiar los eventos que ocurren en la degeneración retiniana provocada por el estrés oxidativo. Específicamente, hemos estudiado la función de las siguientes isoformas de la fosfolipasa A2 (PLA2): la isoforma citosólica (cPLA2), la isoforma independiente de calcio (iPLA2) y la isoforma secretoria (sPLA2), durante la toxicidad retiniana inducida por Fe2+. También analizamos las implicancias de las diferentes PLA2s en la regulación de la ciclooxigenasa (COX)-2, el factor de transcripción nuclear kappa B (NF-κB, del inglés nuclear factor kappa B) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAKP, del inglés mitogen-activated protein kinase). En retinas enteras aisladas y expuestas a concentraciones crecientes de Fe2+ (25, 200 o 800 M) o a su vehículo, logramos determinar cuál es la incorporación efectiva de Fe por medio de técnicas analíticas e histoquímicas (espectrometría de emisión atómica por plasma de acoplamiento inductivo y tinción de Perls). El estrés oxidativo asociado a esta incorporación fue evaluado a través del estudio de diversos parámetros, tales como los niveles de peroxidación lipídica, la generación de dienos conjugados, la funcionalidad mitocondrial, la capacidad antioxidante de la retina, y la integridad de la membrana celular. La incorporación de Fe en las retinas fue dependiente de la concentración de Fe2+ utilizada en cada incubación. Esta acumulación de Fe produjo un incremento tiempo- y concentración-dependiente en los niveles de peroxidación lipídica de la retina. Por su parte, la viabilidad mitocondrial solo se vio afectada en menor grado luego de 60 minutos de exposición a la injuria oxidativa. Los niveles de dienos conjugados sufrieron un incremento tiempo-dependiente en tanto que la capacidad de captación de radicales libres solo se vio afectada a altas concentraciones de Fe2+. En concordancia con estos resultados, se observó que la pérdida de la integridad de la membrana celular evidencia un leve incremento en las retinas expuestas a todas las concentraciones de Fe2+ consideradas. Los niveles de peroxidación lipídica, la viabilidad celular y la pérdida de integridad de la membrana celular también fueron analizados en presencia de inhibidores específicos de las distintas isoformas de la PLA2, a saber araquidonoil trifluorometil cetona (ATK, del inglés arachidonoyl trifluoromethyl ketone –inhibidor de la cPLA2–), bromoenol lactona (BEL, del inglés bromoenol lactone –inhibidor de la iPLA2–) e YM 26734 (inhibidor de la sPLA2). La pre-incubación de las retinas con ATK provocó una disminución de los niveles de peroxidación lipídica y también una inhibición de la activación de las proteínas quinasas reguladas por señal extracelular (ERK1/2, del inglés extracellular signal-regulated kinase) a bajas y medianas concentraciones de Fe2+. Por su parte, el inhibidor BEL provocó un aumento en los niveles de peroxidación lipídica y retrasó la activación de las ERK1/2. En cuanto al inhibidor YM 26743, si bien este no demostró tener efecto alguno en la peroxidación lipídica, sí demostró tener la capacidad de retrasar la activación de las ERK1/2. También fue posible observar que ninguno de estos inhibidores afecta la viabilidad celular ni la permeabilidad de la membrana plasmática. Se detectó también una liberación diferencial de ácido araquidónico (AA, del inglés arachidonic acid) y de ácido palmítico (PAL, del inglés palmitic acid) catalizada por la cPLA2 y la iPLA2, respectivamente, en las fracciones microsomales y citosólicas obtenidas a partir de retinas incubadas con Fe2+. En el caso de la cPLA2, demostramos que, en respuesta a la incubación con Fe2+, la forma activa (la forma fosforilada en los residuos de Serina 505) se encuentra asociada principalmente a las fracciones citosólicas y que dicha asociación disminuye en las fracciones microsomales. Fue posible demostrar también que el perfil de liberación de AA producido por la actividad de la cPLA2 se encuentra regulado por acción de las ERK1/2 ya que la inhibición de estas quinasas por medio del inhibidor U0126 provocó la completa abolición de la liberación diferencial del AA. Por otra parte, observamos que la liberación de AA disminuye a la vez que la asociación de la proteína COX-2 aumenta en los microsomas de las retinas expuestas al Fe2+. Se observó también que la sPLA2 se localiza en la fracción citosólica de manera concentración-dependiente. Mediante ensayos de inmunoprecipitación fue posible observar que aumenta la asociación entre la sPLA2 y la proteína COX-2 en las retinas expuestas a la sobrecarga de Fe2+. Sin embargo, a pesar de la mayor asociación de esta proteína con la sPLA2, la generación de prostaglandinas se vio disminuida. Al estudiar los niveles de p65 (RelA) NF-κB encontramos que estos aumentan en las fracciones nucleares de las retinas expuestas a Fe2+. En presencia de los inhibidores ATK e YM 26734, observamos que la localización nuclear de ambas subunidades de NF-κB, p65 y p50, es restaurada a los niveles control en las retinas expuestas al estrés oxidativo inducido por Fe2+. 4 Resumen Los mecanismos de reparación de la membrana también fueron analizados mediante el estudio de la participación de las aciltransferasas en la remodelación fosfolipídica que ocurre durante el estrés oxidativo sufrido por la retina. Los fosfolípidos acídicos, tales como el fosfatidilinositol (PI) y la fosfatidilserina (PS), mostraron una inhibición en el perfil de acilación en las retinas expuestas a Fe2+ mientras que la fosfatidiletanolamina (PE) mostró resultados opuestos. El uso de inhibidores de la PLA2 demostró que la PS es activamente deacilada durante el estrés oxidativo inducido por Fe2+. Nuestros resultados demuestran que las distintas isoformas de la PLA2 participan en diferentes mecanismos regulatorios en este modelo experimental que mimetiza la DME del siguiente modo: i) la cPLA2 promueve el daño inducido por el estrés oxidativo dado que cumple una función en la señalización inflamatoria, liberando AA. ii) La iPLA2 tiene un rol protector debido a que interviene en la remodelación de las membranas mediante la remoción de los ácidos grasos peroxidados, lo cual atenúa los efectos nocivos del Fe2+ sobre las membranas celulares. iii) La sPLA2 Grupo V tiene múltiples blancos intracelulares relacionados con la respuesta inflamatoria porque participa en la regulación del factor NF-κB y de la proteína COX-2. Los hallazgos aquí presentados aportan nuevos conocimientos acerca de los mecanismos moleculares que operan en la degeneración retiniana inducida por el estrés oxidativo.

Iron (Fe) accumulation and oxidative stress are hallmarks of retinas in patients with age-related macular degeneration (AMD). In this thesis work we have characterized an in vitro model of iron-overloaded bovine retinas for the study of retinal degeneration during iron-induced oxidative stress. In particular, we have studied the role of the different phospholipase A2 (PLA2) isoforms, namely cytosolic isoform (cPLA2), calcium-independent isoform (iPLA2) and secretory isoform (sPLA2) during iron-induced retinal toxicity. Furthermore, we have analyzed the implications of PLA2s in the regulation of cyclooxigenase (COX)-2, nuclear factor kappa B (NF-κB) and MAPK pathways. In isolated retinas exposed to increasing Fe2+ concentrations (25, 200 or 800 M) or its vehicle, the effective iron incorporation into retinas was analyzed by means of analytical and histochemical techniques (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy and Perls´ staining). Oxidative stress associated to this incorporation was also analyzed taking into account several parameters, such as lipid peroxidation and conjugated diene levels, mitochondrial function, anti-oxidant ability and cell membrane integrity. Fe accumulation led to a time- and concentration-dependent increase in retinal lipid peroxidation levels whereas retinal cell viability was only affected after 60 minutes of oxidative injury. Conjugated diene levels underwent a time-dependent increase whereas radical scavenging ability was only affected at high Fe2+ concentrations. In agreement with these results, cell membrane integrity was slightly increased at all Fe2+ concentrations. Retinal lipid peroxidation, cell viability and cell membrane integrity were also analyzed in the presence of specific PLA2 isoform inhibitors, namely arachidonoyl trifluoromethyl ketone (ATK, cPLA2 inhibitor), bromoenol lactone (BEL, iPLA2 inhibitor) and YM 26734 (sPLA2 inhibitor). ATK was found to decrease lipid peroxidation levels as well as ERK1/2 activation. BEL showed the same effect on ERK1/2 activation but the opposite effect on lipid peroxidation. YM 26743 was observed to have no effect on lipid peroxidation although it demonstrated to have the ability to delay ERK1/2 activation. None of these inhibitors was found to affect either cell viability or cell membrane permeability. A differential release of arachidonic acid (AA) and palmitic acid (PAL), catalized by cPLA2 and iPLA2 activities, respectively, was also observed in microsomal and cytosolic fractions obtained from Fe2+-incubated retinas. In the case of cPLA2, we demonstrated that in response to Fe2+ incubation, the active form (the phosphorylated form) is associated mainly to the cytosolic fraction whereas this association is lower in the microsomal fraction. We also demonstrated that AA release profile caused by cPLA2 activity is regulated through ERK1/2 action as shown by the complete abolition of AA differential release through ERK 1/2 inhibition. It was also observed that AA release decreases whereas COX-2 association increases in microsomes of the retinas exposed to Fe2+. It could also be observed that sPLA2 is localized in the cytosolic fraction in a concentration-dependent manner. Via immunoprecipitation assays we demonstrated an increase in the association between sPLA2 and COX-2 in the retinas exposed to Fe2+ overload. Furthermore, in spite of the higher association of COX-2 with sPLA2, prostaglandins generation was found to decrease. The analysis of p65 (RelA) NF-κB levels showed that they increased in the nuclear fractions from the retinas exposed to Fe2+. In the presence of ATK and YM 26734, the nuclear localization of both p65 and p50 NF-κB subunits was found to be restored to control levels in the retinas exposed to Fe2+-induced oxidative stress. Membrane repair mechanisms were also analyzed by studying the participation of acyltransferases in phospholipid remodeling during retinal oxidative stress. Acidic phospholipids, such as phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylserine (PS), were observed to show an inhibited acylation profile in the retinas exposed to Fe2+ whereas phosphatidylethanolamine (PE) showed exactly the opposite. The use of PLA2 inhibitors demonstrated that PS is actively deacylated during Fe2+-induced oxidative stress. Our results demonstrate that the PLA2 isoforms analyzed in this Ph. D. thesis participate in different regulatory mechanisms in our experimental model mimicking AMD. Such participation can be summarized as follows: i) cPLA2 promotes oxidative stress-induced damage by having a role in inflammatory signaling; ii) iPLA2 has a protective role by remodeling membranes to remove peroxidated fatty acids, thus attenuating the harmful effects of Fe2+ on cell membranes; iii) Group V sPLA2 has multiple intracellular targets related to the inflammatory response by its participation in the regulation of NF-κB and COX-2. The findings herein reported provide new knowledge about the molecular mechanisms operating in retinal degeneration induced by oxidative stress.