Nano-ceria en la regeneración de tejido óseo

Abstract

En la ciencia de los biomateriales empleados en la regeneración de tejido óseo es esencial desarrollar dispositivos implantables que sean tanto biocompatibles como bioactivos. Además, es sabido que la presencia de especies reactivas de oxígeno que conducen al estrés oxidativo celular y, consecuentemente al retardo en el tiempo de curación de la herida en el sitio de implantación, puede controlarse usando nanopartículas de dióxido de cerio (CeO2) o nanoceria –capaces de alterar su estado de oxidación (de III a IV). En base a estos dos hechos, la presente propuesta se enfoca al diseño de materiales aplicables a la construcción de implantes de tejido óseo basados en dióxido de titanio (TiO2) modificados con nanoceria. El dióxido de titanio es un material generalmente reconocido como biocompatible cuando está presente en la superficie de implantes metálicos de titanio, por lo cual representa un elemento de partida conveniente para el desarrollo de estos nuevos materiales. La presencia de nanoceria permitiría controlar la producción de especies reactivas de oxígeno favoreciendo el crecimiento de nuevo hueso y la biointegración del implante. Para la síntesis de los materiales se emplearon sistemas de microemulsiones agua/butanol/CTAB/heptano como agentes directores de estructura, utilizando isopropóxido de titanio y tripentanoato de cerio como precursores inorgánicos de Ti y Ce, respectivamente. La incorporación del Ce se realizó de dos maneras: disolviendo la sal en el cosurfactante o como nanopartículas de CeO2 suspendidas en la fase oleosa de la microemulsión. Luego de estudiar y optimizar las condiciones de síntesis, se obtuvieron tres materiales: A (TiO2), B (Ce-TiO2) y C (CeO2- TiO2). Asimismo, y como parte del proceso de optimización de las condiciones de síntesis, se evaluó una serie de materiales con contenido creciente de cerio, que se ha dado en llamar B1-B8, por sus condiciones de síntesis análogas a la del material B. Por sus particularidades morfológicas y de almacenamiento de oxígeno, también se dedica una parte de este trabajo de investigación al estudio de sus propiedades. Se estudiaron las propiedades texturales y químicas, lo cual incluye la determinación del tamaño de partículas, el grado de hidrofobicidad, la estructura cristalina, la topografía y tamaños de poro. La capacidad de un material para integrarse con el tejido óseo fue evaluada examinando la interacción con una proteína plasmática modelo, albúmina, y la habilidad del mismo para inducir la formación de hidroxiapatita (HAp) sobre su superficie cuando es sumergido en suero fisiológico simulado, que es una solución cuya concentración de iones es comparable a la del plasma sanguíneo. Como resultado de este ensayo pudo observarse que los materiales A, B y C son capaces de inducir la formación sobre su superficie de una capa de cristales de fosfatos de calcio cuya relación Ca/P es comparable con la de HAp estequiométrica. Debido a que gran parte del daño tisular provocado durante el proceso de implantación es atribuido a la presencia de radicales NO• y O2 •- que son liberados, en condiciones fisiológicas, por macrófagos activados y neutrófilos, resultó interesante evaluar la capacidad de los materiales aquí presentados para eliminar estas especies reactivas de oxígeno. In vivo, la reacción de estos radicales conduce a la formación de peroxinitrito (ONOO-) y peróxido de hidrógeno (H2O2), dos moléculas con alto poder oxidante y, por lo tanto, citotóxicas. Se realizaron ensayos de degradación de estas especies reactivas, observándose que los materiales A, B y C son capaces de acelerar la descomposición de ONOO-; y que B es capaz de descomponer H2O2 en presencia de aniones fosfato mediante dos mecanismos diferentes que son dependientes de la concentración. La biocompatibilidad de los materiales, esto es, su capacidad para interactuar con tejidos vivos sin causar toxicidad o reacciones fisiológicas negativas, es una característica que también fue estudiada en el transcurso de esta tesis. Para ello se realizaron estudios de viabilidad y morfología celular utilizando cultivo primario de osteoblastos de calvaria de rata y una línea celular de fibroblastos de ratón (L929). En ambos casos no se observaron diferencias significativas en la viabilidad luego de 24, 48 y 72 horas de incubación en presencia de los materiales ni tampoco cambios morfológicos en los osteoblastos. El estudio con fibroblastos arrojó algunas diferencias entre los materiales respecto de la supervivencia y la capacidad de adhesión luego de 24 horas de incubación, poniéndose de manifiesto la existencia de una potencial incompatibilidad biológica del material C. Finalmente se evaluó el efecto citoprotector frente al estrés oxidativo inducido por H2O2, con particular hincapié en el material B, debido a sus propiedades bioactivas, biocompatibles y óxido reductoras. El estudio se realizó utilizando fibroblastos de ratón (L929) como modelo celular, observándose un claro aumento en la supervivencia de aquellas células tratadas con B respecto de las células sin tratar y de las tratadas con el material sin cerio (TiO2). Se observó también que el efecto citoprotector es concentración dependiente. De este trabajo se destaca el desarrollo de un material basado en dióxido de titanio y dopado con cerio (material B, Ce-TiO2), obtenido a través de un método sencillo. Este material combina características morfológicas, topográficas y químicas apropiadas que lo convierten en un candidato potencial para su uso en implantes por su capacidad para promover su osteointegración y al mismo tiempo, de proteger al tejido circundante frente al estrés oxidativo producto del proceso de inserción quirúrgico.

In the science of biomaterials used in bone tissue regeneration it is essential to develop implantable devices that are both biocompatible and bioactive. It is also known that the presence of reactive oxygen species (ROS) leading to cellular oxidative stress at the site of implantation and the consequent wound healing delay, can be controlled using cerium dioxide (CeO2) nanoparticles, nanoceria –that are able to alter their oxidation state (from III to IV). Based on these two facts, this proposal focuses on the design of materials applicable towards the construction of bone tissue implants based on titanium dioxide (TiO2) modified with nanoceria. Titanium dioxide is generally regarded as biocompatible when it is present on the surface of metallic titanium implants. Therefore, it represents a suitable starting element for the development of these new materials. The presence of nanoceria would allow controlling the production of reactive oxygen species favoring newly bone formation and the bio-integration of the implant. For the synthesis of the materials, microemulsion based on water/CTAB/butanol/heptane system were used as structuring agents, using titanium isopropoxide and cerium tripentanoate as inorganic precursors of Ti and Ce, respectively. The incorporation of cerium was performed in two ways: either by dissolving the salt in the co-surfactant or by suspended CeO2 nanoparticles in the oleic phase of the microemulsion. After studying and optimizing the synthesis conditions, three materials were obtained: A (TiO2), B (Ce-TiO2) and C (CeO2-TiO2). Also, as part of the process of optimization of the synthesis conditions, a series of materials was evaluated with increasing content of cerium, which has been called B1-B8, because their synthesis conditions were similar to those applied to obtain material B. Due to their morphological and oxygen storage features, a part of this research is also dedicated to the study of their properties. Regarding the materials A, B and C, textural and chemical properties were studied, including the determination of particle size, hydrophobicity, crystal structure, topography and pore sizes. The ability of a material to integrate with bone tissue was evaluated by examining the interaction with a model of plasmatic protein, albumin, and also the ability to induce the formation of hydroxyapatite (HAp) on its surface when it is immersed in simulated body fluid that is a solution which its ion concentration is comparable to that of blood plasma. As a result of this trial it could be observed that materials A, B and C are able to induce the formation of a layer of calcium phosphate crystals and their Ca/P ratio is comparable to that of stoichiometric HAp. Due to a great extent of the tissue damage caused during the implantation process is attributed to the presence of radicals NO• and O2 •-, which are released by activated macrophages and neutrophils under physiological conditions, it was interesting that test the ability of materials presented here to eliminate these reactive oxygen species. In vivo, the reaction of these radicals leads to the formation of peroxynitrite (ONOO-) and hydrogen peroxide (H2O2), two highly oxidant molecules; therefore, cytotoxic. Degradation assays for these ROS were carried out, observing that materials A, B and C are able to accelerate the decomposition of ONOO-; B, on the other hand, is also able to decompose H2O2 in presence of phosphate anions by two different mechanisms that are concentration-dependent. The biocompatibility of these materials, this is, their ability to interact with living tissues without causing toxicity or adverse physiological reactions, is a feature that was also studied during this research. These experiments involved the evaluation of viability and cell morphology of two cellular models: primary culture of pre-osteoblasts from rat calvaria and a cell line of mouse fibroblasts (L929). In both cases no significant differences in viability or morphological changes were observed in pre-osteoblasts after 24, 48 and 72 hours of incubation in presence of the materials. The study with fibroblasts showed some differences between materials in terms of rate of survival and their adhesion ability after 24 hours of incubation, demonstrating the existence of a potential biological incompatibility of material C. Finally the cytoprotective effect against oxidative stress induced by H2O2 was evaluated, with particular emphasis on material B, due to its bioactive, biocompatible and redox properties. The study was performed using mouse fibroblast (L929) as cell model, showing a visible increase in the survival rate of those cells treated with material B when compared to untreated cells and/or cells treated with the material without cerium (TiO2). It was noted that the cytoprotective effect is also concentration-dependent. From this work it stands out the development of a novel material based on titanium dioxide and doped with cerium (material B, Ce-TiO2), obtained through a simple method. This material combines suitable morphological, topographic and chemical characteristics that make it a potential candidate for bone implant due to its ability to promote osseointegration while protecting the surrounding tissue against oxidative stress resulting from the process of surgical insertion.