Efectos antitumorales de la fracción D de Grifola frondosa (Maitake) en cáncer de mama

Abstract

La Fracción D es un proteoglucano obtenido del hongo comestible Grifola frondosa (Maitake). Existe evidencia de que la Fracción D presenta efectos anticancerígenos en distintas etapas de la progresión tumoral. Sin embargo, estos efectos han sido poco explorados en el caso del cáncer de mama. En este contexto, nos proponemos investigar los posibles efectos terapéuticos de la Fracción D en este tipo de cáncer. Los efectos antineoplásicos de la Fracción D han sido atribuidos tradicionalmente a su capacidad inmunoestimuladora. Sin embargo, recientemente se comenzó a observar que dicha fracción podría actuar de manera independiente del sistema inmune sobre células derivadas de ciertos tipos tumorales. Por esta razón, también nos proponemos identificar los mecanismos celulares y moleculares por los cuales la Fracción D ejercería un efecto antitumoral independiente del sistema inmune en células de cáncer de mama. In cultivo, demostramos que la Fracción D es capaz de actuar sobre células tumorales mamarias, modulando su perfil de expresión génica y afectando diferentes procesos celulares cuya desregulación está implicada en el desarrollo y progresión del cáncer. Particularmente, demostramos que la Fracción D disminuye la viabilidad de células tumorales mamarias hormono independientes (LM3, murinas) y triple negativas (MDA-MB-231, humanas), sin afectar la progresión del ciclo celular e induciendo apoptosis en la línea LM3. Demostramos también que la Fracción D disminuye la capacidad migratoria e invasiva de ambas líneas. En relación a esto, observamos que el proteoglucano aumenta la adhesión de las células tumorales al plástico y la expresión de E-cadherina en ellas. La Fracción D disminuyó la actividad de MMP-2 y MMP-9 secretada por las células tumorales. En relación con la motilidad celular, el proteoglucano afectó la organización del citoesqueleto de actina, disminuyendo el número de lamellipodios/filopodios en las LM3, y la presencia de fibras de estrés en las MDA-MB-231. Por otro lado, la Fracción D presentó un efecto diferencial sobre la viabilidad de células mamarias no malignas (HC11, murinas) afectándolas en menor medida que a su contraparte tumoral. La migración de estas células resultó disminuida por el proteoglucano, mientras la capacidad invasiva no reportó cambios. In vivo, en un modelo murino de trasplante singenéico de células LM3 demostramos que el tratamiento con la Fracción D disminuye la carga tumoral y el número de metástasis pulmonares. La reducción del tamaño tumoral fue acompañada de un incremento de la expresión de Bax, sin registrar cambios el índice mitótico y la expresión de Ki-67. La Fracción D exhibió también un efecto protector en ratones BALB/c, retrasando y/o previniendo el desarrollo tumoral cuando fue aplicado en forma previa a la implantación de células LM3. En el caso de las células MDA-MB-231, los efectos antitumorales del proteoglucano observados in cultivo no pudieron ser fehacientemente corroborados in vivo. En conjunto, los resultados de esta tesis apoyan el potencial empleo de la Fracción D de Maitake como agente terapéutico en cáncer de mama y dan muestra de su efecto sobre procesos celulares independientemente del sistema inmunológico por medio de los cuales el proteoglucano también estaría ejerciendo su efecto antitumoral.

D-Fraction is a proteoglucan extracted from the edible mushroom Grifola frondosa (Maitake). There is evidence that D-Fraction has antitumoral effects over different stages of tumor progression. However, these effects have been poorly investigated in breast cancer. In this context, we propose to investigate the potential therapeutic effects of D-Fraction in this type of cancer. The antitumoral effect of D-Fraction has long been traditionally attributed to their immunostimulatory capacity. However, in recent years evidence emerged showing that this proteoglucan could act, independently of the immune system, on certain tumor cells types. For this reason, we propose to identify the cellular and molecular mechanisms by which D-Fraction could exert an immune system-independent antitumoral effect in breast cancer. In culture, we showed that D-Fraction is capable of acting on breast tumor cells by modulating their gene expression profile and by affecting different cellular processes whose dysregulation is implicated in the development and progression of cancer. In particular, we demonstrated that D-Fraction decreases the viability of murine hormone-independent LM3 and human triple-negative MDA-MB-231 breast cancer cells, without affecting cell cycle progression but rather by inducing apoptosis in LM3 cell line. We also demonstrated that D-Fraction decreases the migratory and invasive capability of both tumor lines. In relation whit this, we observed that the proteoglucan increases breast cancer cell plastic adhesion and also the expression of E-cadherin in them. D-Fraction decreases the activity of MMP-2 and MMP-9 secreted by tumor cells. In association with cell motility, the proteoglucan affected the actin cytoskeleton organization by decreasing the number of lamellipodia/filopodia in LM3 cells, and the presence of stress fibers in MDA-MB-231 cells. On the other hand, D-Fraction showed a differential effect on the viability of non-malignant breast cells HC11 (murine cells) affecting it to a lesser extent than their tumor counterparts. The HC11 cell migration was decreased by the proteoglucan’s treatment while their invasive capability was unchanged. In vivo, in a murine model of syngeneic transplantation with LM3 cells, we demonstrated that D-Fraction treatment reduces tumor burden and the number of lung metastases. The reduction of tumor size was accompanied by an increase in the expression of Bax and not significant changes in the mitotic index and expression of Ki-67 were observed. D-Fraction also showed a protective effect in BALB/c mice by delaying and/or preventing tumor growth when it was applied before the implantation of LM3 cells. The antitumoral effects of the proteoglucan on MDA-MB-231 cells observed in culture could not be conclusively corroborated in vivo. Together, the results obtained in this thesis support the potential use of Maitake D-Fraction as a therapeutic agent in breast cancer and they demonstrate the effect of D-Fraction on cellular processes, independently of the immune system action, by means of which the proteoglucan would also exert its antitumor effect.