Cultivo y análisis lipídico de la diatomea Navicula cincta, aislada del estuario de Bahía Blanca (Pcia. Bs. As., Argentina) : evaluación del potencial uso biotecnológico

Abstract

El biodiesel se obtiene a nivel industrial, casi en su totalidad, a partir de aceites de semillas. Sin embargo, el incremento de la demanda energética, el uso del agua dulce y la utilización de semillas con fines alimenticios plantean la necesidad y búsqueda de nuevas fuentes de materias primas sustentables que, además, posean impactos mínimos sobre el medio ambiente. Muchas especies de microalgas, denominadas oleaginosas, han despertado gran interés como fuente potencial de lípidos neutros (LN), específicamente triglicéridos (TAG), considerados la materia prima ideal para la producción de biodiesel. Una posible estrategia para mejorar los costos de producción del biodiesel de tercera generación es la búsqueda y selección de especies nativas de microalgas que, además de producir TAG, sean capaces de sintetizar productos de alto valor agregado. Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo general de esta tesis fue evaluar el potencial de una especie de diatomea nativa del Estuario de Bahía Blanca como materia prima para la producción de biodiesel y sustancias poliméricas extracelulares como co-productos de valor agregado, bajo un concepto de biorrefinería. Los objetivos específicos planteados fueron: 1) la identificación de la especie; 2) la optimización de técnicas para la determinación de la densidad celular, la concentración de pigmentos fotosintéticos y el contenido de lípidos neutros en cultivos a escala de laboratorio; 3) analizar el efecto de distintas condiciones ambientales (temperatura [15ºC y 20ºC], medios de cultivo [f/2, SWES, y SWES-N] y la fase estacionaria sobre parámetros de crecimiento, producción de biomasa, cantidad y calidad de lípidos y productividad lipídica con especial énfasis en la fracción de lípidos neutros; 4) evaluar el potencial de las sustancias poliméricas extracelulares liberadas por N. cincta como co-producto de valor; y 5) analizar el crecimiento de la especie en un fotobiorreactor columnar de 25L. Los estudios morfológicos con microscopios óptico y electrónico de barrido permitieron identificar a la especie en estudio como Navicula cincta, una diatomea pennada. La cepa fue depositada en el Culture Collection of Autotrophic Organism (CCALA), República Checa, bajo la denominación Navicula cincta CCALA 984. La velocidad de crecimiento de N. cincta varió entre 0,29 div. día-1 y 1,42 div. día-1, mientras que el tiempo de generación varió entre 16,8 horas y 82,5 horas. Las máximas densidades celulares (DC) fueron obtenidas con el medio SWESN. Se estableció un modelo entre la DC y la absorbancia, el cual permitió monitorear el crecimiento de N. cincta en f/2. La espectrofluorometría de la clorofila a se presentó como un método adecuado para evaluar la cinética de crecimiento y para obtener información sobre el estado fisiológico de los cultivos. La cinética de clorofila a in vivo presentó la misma dinámica que la de la DC en los tres medios de cultivo testeados. El medio f/2 resultó adecuado para producir un rápido crecimiento seguido de una fase estacionaria temprana, mientras que los medios SWES y SWES-N permitieron un crecimiento sostenido a lo largo de todo el período considerado. La relación IFR-Cel establecida entre la intensidad de fluorescencia relativa del cultivo teñido con Rojo Nilo (IFR-RN) y la DC se propone como un índice para estimar el tiempo de acumulación máxima de LN y, por lo tanto, determinar el tiempo de cosecha de la biomasa. Esta información resultó útil para cultivos llevados a cabo en medio f/2, pero no así en los desarrollados en los medios SWES y SWES-N, debido a que en éstos últimos no se detectó acumulación lipídica. El contenido de lípidos totales (LT) de N. cincta varió entre 6-40 % del peso seco libre de cenizas (% PSLC). En las condiciones de crecimiento evaluadas, los LN o TAG representaron entre un 50 % y 90% de los LT. La mayor productividad de LN fue de 10 mg. L-1. d-1 en los cultivos creciendo a 20°C en f/2 durante 10 días. Los valores más bajos de LT y LN se obtuvieron con los medios SWES y SWES-N, sugiriendo que en estos medios no hubo acumulación lipídica. Con respecto a la composición de los LN, los ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) fueron la clase dominante representando el 53% a 60%, seguida por los ácidos grasos saturados (AGS) que constituyeron entre el 22% a 28%. Una excepción a este patrón ocurrió en los cultivos en SWES-N, donde los contenidos de AGMI y AGS de la fracción neutra fueron similares (39% y 38%, respectivamente). Los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) fueron la fracción minoritaria en todos los casos testeados. El perfil de ácidos grasos de la fracción neutra fue similar en todas las condiciones de cultivo testeadas. Los principales ácidos grasos fueron los ácidos palmítico (16:0), palmitoleico (16:1 (n-7)) y eicosapentaenoico (20:5 (n-3)). En relación a los parámetros de calidad del aceite, el índice de Yodo y el contenido de ácido linolénico estuvieron dentro de los límites establecidos por el estándar de calidad europeo EN14214. Estas características permiten inferir que los aceites de N. cincta se presentan como una materia prima adecuada para la producción de biodiesel. En las cinéticas de nutrientes se pudo observar una limitación de fósforo y sílice en el medio f/2, durante la fase estacionaria. En los medios SWES y SWES-N, los nutrientes no alcanzaron valores limitantes para el crecimiento, lo cual se visualizó en un incremento sostenido en la DC y en la baja acumulación de LN. Las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de N. cincta fueron clasificadas en EPS solubles (EPS-S), EPS levemente unidos a la célula (EPSLU) y EPS fuertemente unidos (EPS-FU) a la célula. Las cinéticas de producción de las mismas fueron analizadas en los tres medios de cultivo. Los EPS-S fueron el principal constituyente en los medios f/2 y SWES (77% y 86% de los EPS totales, respectivamente), mientras que en SWES-N representaron la tercera parte del total de EPS. La producción media de los EPS-S estaría relacionada con las relaciones estequiométricas N/P. En general, los EPS-FU fueron más abundantes que los EPS-LU y esto podría estar asociado al hábito bentónico de la especie. La composición de monosacáridos neutros de los EPS-S fue similar a la de los EPS-FU. Sus principales componentes fueron xilosa, manosa y N-acetilglucosamina. Los EPS-LU estuvieron mayormente constituidos por galactosa y glucosa. La relación carbohidrato:proteína y la identificación de la N-acetilglucosamina y la N-acetilgalactosamina sugieren la presencia de proteoglucanos y/o glicoproteínas en los EPS. Navicula cincta fue cultivada en un fotobiorreactor columnar con medio SWESN y con CO2. Los cultivos presentaron una fase exponencial, estacionaria y una de disminución celular, no detectada a escala de laboratorio. La producción de biomasa fue de 319 mg. L-1. La cinética espectrofluorométrica del Rojo Nilo evidenció acumulación de LN durante la fase estacionaria. El contenido de LT fue de 32 % PSLC, representando los LN un 81 % de los LT. La productividad de los LN fue de 51 mg. L-1.d-1. Con respecto a la composición de ácidos grasos de los LN, el porcentaje de AGMI fue de 51%, mientras que los de AGS y AGPI fueron de 32% y 16%, respectivamente. Los principales ácidos grasos fueron los ácidos palmítico, palmitoleico y eicosapentaenoico. De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede concluir que la microalga oleaginosa Navicula cincta puede ser considerada como una especie potencialmente útil para la producción de biodiesel. Además, la producción simultánea de TAG para biodiesel y de EPS como co-producto, bajo un contexto de biorrefinería, se presenta como una propuesta novedosa para ser aplicada en cultivos energéticos sustentables.

Biodiesel is obtained at industrial level almost entirely from seed oils. However, factors like increasing of the demand of energy, freshwater use and the utilization of seeds for food purposes suggest the need and search for new sources of sustainable and alternative feedstocks, which have minimal impacts on the environment. Many species of microalgae, called oleaginous, have raised great interest as a potential source of neutral lipids, specifically triglycerides (TAG), which are considered the ideal feedstock for biodiesel production. A possible strategy for improving the cost of production of thirdgeneration biodiesel is the search and selection of microalgae native species that can produce TAG and could be able to synthesize valuable co-products. On the basis of previous background, the objective of this thesis was to evaluate the potential of a native diatom from Bahía Blanca Estuary as raw material for both biodiesel production and extracellular polymeric substances as valuable co-products, under a concept of biorefinery. The specific objectives were: 1) to identify the species; 2) to optimize different techniques for the determination of cell density, the photosynthetic pigment concentration and the content of neutral lipids in cultures at laboratory scale; 3) to analyse the effect of different environmental conditions (temperature [15°C and 20°C], culture media [f/2, SWES, SWES-N] and stationary phase) on growth parameters, biomass production, lipid quantity and quality and lipid productivity, with particular emphasis on neutral lipid fraction; 4) to evaluate of the potential of the extracellular polymeric substances released by N. cincta as an added value coproduct; 5) to analyse the growth of the species in a 25L columnar photobioreactor. Both morphological studies with optical and scanning electronic microscopes allowed identifying the studied strain as Navicula cincta, a pennate diatom. The strain was deposited in the Culture Collection of Autotrophic Organism (CCALA), Czech Republic, under the name Navicula cincta CCALA 984. The growth rate of N. cincta ranged between 0,29 div. día-1 and 1,42 div. día-1, while the time of generation ranged between 16,8 hours y 82,5 hours. The maximum cell densities (CD) were obtained with the SWES-N medium. A model between the CD and the absorbance was established. It allowed monitoring the growth of N. cincta in f/2. The spectrofluorometry of chlorophyll a was presented as an adequate method to evaluate the kinetic of growth and to give information about the physiological state of the cultures. The kinetic of the chlorophyll a in vivo presented the same dynamic as the CD in the three culture media tested.The f/2 medium was suitable for producing a rapid growth followed by an early stationary phase. Moreover SWES and SWES-N media allowed a sustained growth along the all considered period. The relationship IFR-Cel established between the relative fluorescence intensity of Nile Red dyed culture (NR-RFI) and the DC was proposed as an index to estimate the maximum neutral lipids accumulation time and, consequently, to determine the biomass harvesting time. This information was useful for cultures performed in f/2 medium, but this index was not useful for the culture developed in SWES or SWES-N media, because in these media lipid accumulation was not detected. The total lipid content (TL) of N. cincta varied between 6- 40% of ash-free dry weight (% of AFDW). Under growing conditions evaluated, the NL or TAG represented between 50% and 90% of TL. The highest NL productivity was 10 mg. L-1.d-1 in culture growing at 20ºC in f/2 medium for 10 days. The lowest values of TL and NL were obtained with SWES-N and SWES, suggesting that, in these culture media, there was not lipid accumulation. Respect of the composition of LN, monounsaturated fatty acids (MUFA) were the dominant class representing from 53% to 60%, followed by saturated fatty acids (SFA) that they constituted from 21% to 28%. An exception of this pattern occurred in SWES-N culture, where the contents of MUFA and SFA of NL were similar (39% and 38%, respectively). Polyunsaturated fatty acids (PUFA) were the minority fraction in all tested cases. The fatty acid profile of the neutral fraction was similar under all evaluated culture conditions. The main fatty acids were the acids palmitic (16:0), palmitoleic (16:1 (n-7)) and eicosapentaenoic (20:5 (n-3)). Regarding to oil quality parameters, iodine index and content of linolenic acid were within the limits established by European quality standard EN14214. These features allowed inferring that the oils of N. cincta constitute a suitable feedstock for biodiesel production. In the kinetics of nutrients could be observed a limitation of phosphate and silicate in f/2 medium, during early stationary phase. In the SWES and SWES-N media, nutrients did not reach limiting values for growth, which was visualized in a sustained increase of DC and lower accumulation of LN. Extracellular polymeric substances (EPS) of N. cincta were classified into soluble EPS (S-EPS), cell loosely bound EPS (LB-EPS) and cell tightly bound EPS (TB-EPS). The kinetic of production of these was analyzed in the three culture media. The EPS-S was the major component in both f/2 and SWES media (77% and 86% of the total EPS, respectively), while in SWES-N it was a third of the total EPS. The average production of EPS-S would be related to stoichiometric ratios N / P. In general, the TB-EPS were more abundant than the LB-EPS and this could be associated with the benthic habit of the species. The S-EPS and TB-EPS neutral monosaccharide composition was similar. Their main components were xylose, mannose and N-acetylglucosamine. The LB-EPS was largely constituted by galactose and glucose. The carbohydrate:protein ratio as well as the identification of N-acetylgalactosamine and N-acetylglucosamine suggest the presence of proteoglycans and/or glycoproteins in the EPS. Navicula cincta was grown in a columnar photobioreactor with SWES-N and CO2. The culture exhibited exponential phase, stationary phase and cell decreased phase that was not detected at laboratory scale. Biomass production was 319 mg. L-1. The kinetic of the spectrofluorometry of Nile Red showed accumulation of LN during stationary phase. The content of TL was 32 (% AFDW), being the NL 81% of TL. The NL productivity was 51 mg. L-1.d-1. In regard to fatty acid composition of NL, MUFA percentage was 51%, while the SFA and PUFA were 32% and 16%, respectively. The main fatty acids were the acids palmitic, palmitoleic and eicosapentaenoic. According to the obtained results, it is concluded that the oleaginous microalgae Navicula cincta can be considered as a potentially useful species for production of biodiesel. In addition, the simultaneous production of TAG for biodiesel and EPS as co-product, under a biorefinery context, is presented as a novel proposal to be applied in sustainable energetic cultures.