Evaluación del potencial de una cepa nativa de Nannochloropsis oceanica CCALA 978 (Eustigmatophyta) como fuente de materia prima para la producción de biodiesel

Abstract

La producción de biodiesel ha crecido durante los últimos años a nivel mundial, en respuesta al paulatino agotamiento de los recursos fósiles y a los efectos ambientales causados por el uso de los combustibles convencionales. Este biocombustible se obtiene a nivel industrial casi en su totalidad a partir de aceites de semillas. Sin embargo, la gran demanda energética, el agotamiento de los suelos y la utilización de semillas para fines alimenticios plantean la necesidad de nuevas fuentes de materia prima alternativa y sustentable. Muchas especies de microalgas, comúnmente denominadas oleaginosas, pueden almacenar altos contenidos de aceites, lo cual las convierte en una fuente potencial para la producción de este biocombustible. Algunas especies del género Nannochloropsis han sido propuestas para tal fin debido a su capacidad de acumular altos contenidos de lípidos, particularmente lípidos neutros, los cuales son la materia prima ideal para la producción de biodiesel. En Argentina, a diferencia de otras energías renovables, las investigaciones en este campo se encuentran en una etapa incipiente. Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo general de esta Tesis fue evaluar el potencial de una cepa marina nativa de Nannochloropsis, aislada de la costa atlántica sur, como materia prima para la producción de biodiesel. Particularmente, los objetivos específicos fueron: la identificación a nivel de especie de la cepa en estudio a través de su caracterización morfológica y molecular; la optimización de técnicas para la determinación de la densidad celular, la concentración de pigmentos fotosintéticos y el contenido de lípidos neutros en cultivos a escala de laboratorio; el análisis del efecto de distintas condiciones ambientales (temperatura [15ºC y 25ºC], intensidad de luz [100 y 300 μmol fotón m-2 s-1] y fotoperiodo [12:12 h y 16:8 h de luz y oscuridad) y de la carencia de nitrógeno sobre parámetros de crecimiento, producción de biomasa y cantidad, productividad y calidad lipídica, con especial énfasis sobre la fracción de los lípidos neutros. Además, se evaluó el crecimiento de la cepa en estudio en un fotobiorreactor columnar de 25L y con un medio de cultivo (SWES) de menor costo que el empleado en experiencias de laboratorio (f/2). Los estudios morfológicos y ultraestructurales con microscopios óptico y electrónico y el análisis de los genes nuclear y cloroplástico, 18s rADN y rbcL respectivamente, permitieron identificar a la cepa en estudio como Nannochloropsis oceanica. La cepa fue depositada en el cepario Culture Collection of Autotrophic Organism (CCALA), República Checa, bajo la denominación Nannochloropsis oceanica CCALA 978. Se elaboró un modelo estimador de la densidad celular a través de lecturas de densidad óptica, el cual permite monitorear el crecimiento de N. oceanica CCALA 978 en forma rápida. Con respecto a la optimización de métodos para la determinación de pigmentos, el metanol asistido con congelado y descongelado rápido fue el método más efectivo para la extracción de clorofila a y carotenoides totales. El pre-tratamiento de las células con dimetilsulfóxido 5% y la tinción con el fluorocromo rojo Nilo se presentó como una técnica adecuada para la detección in situ de los lípidos neutros por espectrofluorimetría. Asimismo, la relación entre las intensidades de fluorescencia de la clorofila a y del rojo Nilo se propone como un índice para la estimación del tiempo de acumulación máxima de los lípidos neutros y consecuentemente, para la determinación del tiempo de cosecha de la biomasa. El efecto de las variables ambientales sobre los parámetros de crecimiento indicó que a mayor temperatura (25º C), mayor intensidad de luz (300 μmol fotón m-2 s-1) y con un fotoperíodo de 16:8 h L:O, la especie mostró un aumento de la velocidad de crecimiento (0,85 div d-1) a escala de laboratorio. Sin embargo, la producción de biomasa (680 mg L-1) no se incrementó en respuesta a la intensidad de luz más alta. Bajo las condiciones ambientales testeadas en este estudio, el contenido de lípidos totales (LT) de N. oceanica CCALA 978 fue en general alto (24-34%), y esto se debió a una alta proporción de los lípidos neutros (LN), los cuales representaron entre un 82% y 91% de los LT. No obstante, los mayores contenidos lipídicos se obtuvieron, cuando las células crecieron en un medio de cultivo carente de nitrógeno, a ambas intensidades de luz y un fotoperíodo de 16:8 h L:O (LT: 36% peso seco de biomasa [ps] y LN: 32% ps). Bajo estas condiciones, se alcanzaron productividades de LT y LN de 48 mg L-1 d-1 y 43 mg L-1 d-1, respectivamente. Con respecto a la calidad de los lípidos, los ácidos grasos saturados (AGS) y monoinsaturados (AGM) fueron las clases predominantes dentro de los LN, bajo todas las condiciones testeadas, representando conjuntamente entre el 90-96% de los ácidos grasos totales. Los AGS-LN aumentaron a 25°C, 16:8 h L:O y 300 μmol fotón m-2 s-1, mientras que los AGM-LN disminuyeron en respuesta a estas variables. Los ácidos grasos poliinsaturados (AGP) fueron la fracción minoritaria en todas las condiciones de cultivo testeadas. La composición de los ácidos grasos fue similar en todas las condiciones de cultivo probadas, tanto en los lípidos totales como en los lípidos neutros, siendo los principales ácidos grasos el ác. palmítico (C16:0), el ác. palmitoleico (C16:1), el ác. oleico (C18:1n9c) y el ác. eicosapentaenoico (C20:5n3). El ácido palmítico fue el componente mayoritario de los AGS, tanto en los LT como en los LN, e incrementó de manera significativa en función de la mayor temperatura, la mayor intensidad lumínica y la mayor duración de las horas de luz empleados. Dentro de los AGM, el ácido palmitoleico fue el más abundante en todas las condiciones de cultivo en los LT y LN. Se observó un disminución significativa con la temperatura más alta empleada (25°C) y la mayor duración de las horas de luz (16:8 h L:O). El ácido eicosapentaenoico fue el principal componente de los AGP en los LT y LN. Sin embargo, sus valores no superaron el 5%. En relación a los parámetros de calidad del aceite, el índice de Yodo, el número de cetano y el contenido de ácido linolénico estuvieron dentro de los límites establecidos por el estándar de calidad europeo EN14214. Estas características permiten inferir que los aceites de N. oceanica CCALA 978 se presentan como una materia prima adecuada para la producción de biodiesel. En la experiencia de cultivo de N. oceanica CCALA 978 en el fotobiorreactor columnar, se obtuvo un crecimiento sostenido de la cepa con el medio SWES, alcanzando 1,11 g L-1 de biomasa. Sin embargo, la intensidad de luz empleada y el diseño del fotobiorreactor constituyeron un impedimento para maximizar la producción de biomasa. De acuerdo con los resultados obtenidos, se concluye que la cepa nativa Nannochloropsis oceanica CCALA 978 es una microalga oleaginosa y robusta, y por lo tanto se la puede proponer como una fuente microalgal potencialmente útil de aceites para procesos de producción de biodiesel. Además, la información derivada de este trabajo representa una base para la implementación de nuevas estrategias de cultivos con fines bioenergéticos, tendientes a incrementar la biomasa, los contenidos de lípidos y las productividades lipídicas, condiciones indispensables para lograr un proceso potencialmente rentable.

In recent years, biodiesel production has grown worldwide in response to the gradual depletion of fossil resources and the environmental disturbances caused by the use of conventional fuels. Biodiesel is industrially obtained almost entirely from seed oils. However, the high energy demand, the depletion of soils and the use of seeds for food purposes raise the need for new sources of alternative sustainable feedstocks. Many species of microalgae, called oleaginous, can store high oils contents that turn them into a potential source for the production of biodiesel. Some species of Nannochloropsis genus have been proposed for this purpose due to ability to accumulate high lipid contents, in particular neutral lipids, which are considered the ideal feedstock for biodiesel production. Unlike other renewable energies in Argentina, research in this field is at early stage. Based on this background, the overall objective of this Thesis was to evaluate the potential of a native marine Nannochloropsis strain, isolated from the south Atlantic coast, as feedstock for biodiesel production. The specific objectives were followings: identification at specific level of the strain under study by both morphological and molecular characterization; optimization of techniques to determine the cell density, photosynthetic pigments concentration and neutral lipid content at laboratory scale; analysis of the effect of different environmental conditions (temperature [15ºC and 25ºC], light intensity [100 y 300 μmol photon m-2 s-1] and photoperiod [12:12 h and 16:8 h of light:darkness]) and the nitrogen deprivation on growth, biomass production, lipid quantity, lipid productivity and lipid quality, with special emphasis on the neutral lipids fraction. In addition, the growth of the strain under study was evaluated in a 25L columnar photobioreactor, with a culture medium (SWES) cheaper than the one used in laboratory experiments (f/2). Both morphological and ultrastructural studies of light and electron microscopes and the analysis of nuclear and chloroplast genes, 18S rDNA and rbcL respectively, allowed identifying the strain under study as Nannochloropsis oceanica. The strain was deposited in the Culture Collection of Autotrophic Organism, Czech Republic (CCALA) as Nannochloropsis oceanica CCALA 978. An estimation model for cell density was developed through optical density readings. In this way, the growth of N. oceanica 978 CCALA could quickly be monitored. Regarding methods to determine pigment concentration, methanol assisted with rapid freezing and unfreezing was the most effective method for the extraction of chlorophyll a and total carotenoids. Pre-treatment of the cells with 5% dimethyl sulphoxide and the staining with Nile red proved to be a suitable technique for in situ detection of the neutral lipids by espectrofluorimetry. Besides, the ratio between the fluorescence intensities of Chlorophyll a and Nile red was proposed as an index for the estimation of the maximum neutral lipid accumulation period and, consequently, for the determination of the biomass harvesting time. The effect of environmental variables on growth parameters indicated that under higher temperature (25°C), higher light intensity (300 μmol photon m-2 s-1) and a photoperiod of 16:8 h L:D, the species showed increased growth rate (0.85 div d-1) at laboratory scale. However, the biomass production (680 mg L-1) did not increase in response to higher light intensity. Under environmental conditions tested in this study, the content of total lipids (TL) in N. oceanica CCALA 978 was generally high (24-34%). This was due to a high proportion of neutral lipids (NL), which represented between 82% and 91% of TL. However, higher contents were obtained when the cells were grown in a culture medium devoid of nitrogen, at both light intensities and 16:8 h L:D photoperiod (TL: 36% dry weight of biomass [dw] and NL: 32% dw). Under these conditions, the highest productivities of 48 mg L-1 d-1 (TL) and 43 mg L-1 d-1 (NL) were obtained. Regarding the quality of lipids, under all conditions tested, saturated fatty acids (SFA) and monounsaturated fatty acids (MUFA) were the predominant classes within NL, representing both SFA-NL and MUFA-NL 90-96% of total fatty acids. The SFA-NL increased at 25°C, 16:8 h L:D and 300 μmol photon m-2 s-1, while the MUFA-NL decreased in response to these variables. Polyunsaturated fatty acids (PUFA) were the minority class in all tested culture conditions. For all these tests, the fatty acid composition was similar in both TL and NL, being the major fatty acids following: palmitic (C16:0), palmitoleic (C16:1), oleic (C18:1n9c) and eicosapentaenoic (C20:5n3). Palmitic acid was the major component of the SFA, in both TL and NL, and it significantly increased in response to higher temperature and light intensity and longer daylight hours employed. Within MUFA, palmitoleic acid was the most abundant in the TL and NL in all culture conditions. This fatty acid decresed significantly under the highest temperature (25°C) and the longest daylight hours (16:18 h L:D) employed. Eicosapentaenoic acid was the main component of PUFA on TL and NL. However, its values did not exceed 5% under all conditions probed. In regard to oil quality parameters, iodine index, cetane number and content of linolenic acid were within the limits set by European quality standard EN14214. These features allow us to infer that the oils of N. oceanica CCALA 978 constitute a suitable feedstock for the production of biodiesel. Respecting culture experience of N. oceanica CCALA 784 in the columnar photobioreactor, sustained growth of the strain was obtained with the SWES medium, reaching 1.11 g L-1 of biomass. However, both employed light intensity and photobioreactor design were an impediment to maximize biomass production. According to these results, it is concluded that the native strain of Nannochloropsis oceanica CCALA 978 is an oleaginous robust microalga. Therefore, it can be proposed as a potentially useful oil source for biodiesel production processes. In addition, the obtained information represents a basis for the implementation of new strategies for bioenergy cultures, aimed to increase biomass, lipid content and lipid productivities, which are requisites to achieve a potentially profitable process.