Identificación y caracterización de genes relacionados con los cambios de ploidía y la apomixis diplospórica en Eragrostis curvula

Abstract

Eragrostis curvula (Schrad.) Nees, conocida vulgarmente como pasto llorón, es una gramínea forrajera, de origen sudafricano, extensamente cultivada en la zona semiárida templada de Argentina. Es una especie morfológicamente diversa y posee un amplio potencial genético para mejorar las características de resistencia a sequía, frío, productividad y palatabilidad. Desde el punto de vista citogenético se trata de un complejo polimórfico, ya que es un grupo poliploide donde la mayoría de sus miembros se reproducen en forma apomí-ctica. La apomixis es una forma de reproducción asexual (agámica) a través de semillas, que conduce a la generación de progenies genéticamente idénticas a la planta madre. Ha sido descripta en más de 400 especies de angiospermas. La apomixis gametofítica ocurre generalmente en grupos poliploi-des y se cree que ésta probablemente se originó a través de mutaciones en genes de la vía sexual. En el Laboratorio de Biotecnología y Genética Vegetal (CERZOS-Departamento de Agronomía, UNS) se obtuvo, por cultivo in vitro de inflores-cencias de un cultivar tetraploide de pasto llorón, Tanganyika (T), una planta diploide (UNST1122, D). Semillas de esta plan-ta se trataron con colchicina y se obtuvieron dos plantas tetraploides (colchiploides) con un alto grado de sexualidad [UNST1131 (C) y UNST1112 (M)]. Esta serie de plantas per-mite estudiar tanto variaciones producidas por cambio de ploidía como por cambios en el modo reproductivo. El objetivo planteado para esta tesis fue realizar un análisis global del transcriptoma derivado de ovarios diplospóricos y meióticos de esta serie isogénica de pasto llorón, y también del tejido de hoja, de manera de aislar los transcriptos diferenciales por mo-do reproductivo y por cambios de ploidía, y así poder realizar asociaciones genéticas y funcionales sobre los factores deter-minantes de la diplosporía en la especie, especialmente el factor ploidía. A fin de lograr este objetivo se realizó la construcción de bibliotecas de ADNc de la serie euploide isogé-nica (tres bibliotecas de inflorescencias inmaduras pertene-cientes a los genotipos T, D y C, y una biblioteca de hoja del genotipo T), se secuenciaron ESTs de dichas bibliotecas y se hicieron análisis de las ESTs. Además se realizaron estudios de Display Diferencial (DD) de inflorescencias y hojas de la misma serie de plantas, y se secuenciaron y analizaron los transcrip-tos diferenciales por ploidía y modo reproductivo para comple-mentar el estudio de las bibliotecas. De la secuenciación de las bibliotecas se obtuvieron 12.295 ESTs de buena calidad. Luego del ensamblado y agrupamiento, se obtuvieron 8.884 unigenes, incluyendo 1.490 contiguos y 7.394 singletons. El algoritmo BLASTX fue utilizado para el análisis de homología de los unigenes de E. curvula contra la base de datos de Swiss-Prot. Cuarenta y tres por ciento de los genes de Eragrostis encontraron homología con secuencias de trigo (391.939 genes anotados) y cebada (50.423 genes anotados), 49,25% con genes de avena (89.147 genes anotados) y 46,48% con genes de maíz (58.582 genes anotados). Además se detec-taron 254 microsatélites (EST-SSRs) que facilitarán el mapeo utilizando poblaciones segregantes para el carácter apomixis u otros caracteres de calidad forrajera. En los ensayos de DD de inflorescencias inmaduras se generaron en total 4.242 transcriptos y para los experimentos de hoja 7.622. Del total de transcriptos, aproximadamente un 14% de inflorescencias y un 10% de hojas fueron diferenciales entre los distintos genotipos. Estos transcriptos diferenciales integraron tres grupos: los diferenciales por modo reproductivo, los diferen-ciales por ploidía y un grupo particular, los inesperados, que estaban integrados por transcriptos en los que el patrón de expresión era el mismo entre la planta apomíctica tetraploide y diploide sexual, pero distinto en la planta tetraploide sexual. Sesenta (60) bandas de inflorescencias y 42 de hoja fueron clonadas y secuenciadas con éxito. Este número representa un 10,83% y 5,68% del total de bandas diferenciales de inflorescencias y hojas, respectivamente. De los 60 transcrip-tos secuenciados a partir de inflorescencias, 39 (65%) mostraron homología significativa con genes de función conocida. De los 42 transcriptos secuenciados a partir de hojas, 14 (33,33%) mostraron homología con genes de función conocida. Tanto en el análisis de las ESTs como en los DD se mostró que los patrones de expresión de las plantas tetraploides están muy relacionados, mientras que la expresión del genotipo diploide fue significativamente diferente, mostrando que el perfil de expresión, al menos para un gran número de genes, depende del nivel de ploidía. Este comportamiento en la expresión de genes se correlaciona muy bien con la estructura genética y epigenética de la serie en la prueba clásica y parcial de Mantel. Durante la conversión tetraploide-diploide se produce una proporción significativa de modificaciones genéticas y epigenéticas que revierten durante la conversión diploide-tetraploide, lo cual sugiere que algunos loci mantienen una secuencia particular y/o una cierta condición de metilación dependiente del nivel de ploidía. Estas variaciones genéticas y epigenéticas ocurren en un escenario particular de expresión que depende del nivel de ploidía. Sin embargo, un grupo particular de genes mostraron un comportamiento curioso. Ellos se encontraron principalmente silenciados en los genotipos 2x sex. y 4x apo. Este grupo de genes se detectó tanto en los análisis de ESTs como en los realizados mediante la técnica de DD. Ya que las plantas 2x sex. y 4x apo. presentan diferente ploidía y modo reproduc-tivo, el patrón de expresión de estos genes es intrigante. Estos genes candidatos fueron denominados de patrón inesperado o inesperados. La mayoría de los genes de este grupo están sobreexpresados en la planta 4x sex, mientras que están reprimidos en los genotipos 4x apo. y 2x sex. Para explicar la existencia de este grupo de genes inesperados y la relación que podrían llegar a tener con la apomixis y la poliploidía, se plantea que para mantener la sexualidad a nivel tetraploide se requiere de la activación de un grupo de genes en la conversión 2x a 4x, y que esta activación estaría bloqueada (o silenciada) en el genotipo 4x apo, lo que explicaría el grupo de genes silenciados que comparten este genotipo y el diploide sexual.

Eragrostis curvula (Schrad.) Nees, commonly known as "weeping lovegrass" is a forage grass native from South Africa and widely cultivated in temperate semiarid regions of Argentina. It is a morphologically diverse species and has a large genetic potential for improving the characteristics of drought and cold resistance, productivity and palatability. Cytogenetically it constitutes a polymorphic complex, since it is a polyploid group where most members reproduce by apomixis. Apomixis is an asexual reproduction mode through seeds, which leads to the generation of progeny genetically identical to the maternal plant. Apomixis was described in over 400 species of angiosperms. Gametophytic apomixis generally occurs in polyploid groups and probably was origi-nated through mutations of genes from the sexual pathway. In the Laboratory of Plant Genetics and Biotech-nology (CERZOS-Department of Agronomy, UNS), a diploid plant (UNST1122, D) was obtained by in vitro culture of inflores-cences from plants of the tetraploid cultivar Tanganyika (T). Seeds of the diploid plant were treated with colchicine and DMSO and two plants were obtained, both tetraploids (colchi-ploids), with a high level of sexual reproduction [UNST1131 (C) and UNST1112 (M)]. This series of plants allowed the study of genetic and epigenetic variations caused by changes of ploidy and/or by changes in the reproductive mode. The aim of this thesis was to conduct a comprehensive transcrip-tome analysis of meiotic diplosporous ovaries and leaf tissue of the isogenic series, and to isolate the transcripts that are differential by the reproductive mode and/or by ploidy in order to find out the genetic and functional associations on diplos-pory determinant factors in the species, especially ploidy. To achieve this goal the cDNA libraries of the isogenic euploid series were constructed (three of them from immature inflores-cences belonging to the genotypes T, D and C, and one library of leaves of genotype T), ESTs were sequenced and analysed. Studies of Differential Display (DD) of inflorescences and leaves of the same series of plants were also carried out and differential transcripts related to ploidy and the reproduc-tive mode were sequenced and analyzed in order to comple-ment the study of the libraries. A relatively high number of good quality ESTs (12,295) was obtained. After assembly and clustering, 8,884 unigenes were obtained, including 1,490 contigs and 7,394 singletons. Blastx was used for the analysis of homology of the E. curvula unigenes against SwissProt database. Forty-three percent of the Eragrostis genes found homology with sequences of wheat (391,939 annotated genes) and barley (50,423 annotated genes), 49.25% with oat genes (89,147 genes annotated) and 46.48% with Maize genes (58,582 annotated genes). In addition 254 microsa-tellites (EST-SSRs) were detected that will facilitate the mapping for apomixis or other traits like forage quality using segregating populations. In DD experiments 4,242 transcripts of immature inflorescences and 7,622 from leaf were gene-rated. From these transcripts, approximately 14% from inflo-rescences and 10% from leaves were differentials between genotypes. These differential transcripts were divided into three groups: differential related to the reproductive mode, differential between ploidy levels and unexpected, a particular group which were composed of transcripts in which the expression pattern was similar in the tetraploid apomictic and in the diploid sex plant, but different in the sexual tetraploid plant. Sixty (60) bands from inflorescences and 42 from leaves were successfully cloned and sequenced. This number represents a 10.83% and 5.68% of the total differential bands from flowers and leaves, respectively. Thirty nine (39, 65%) out of 60 sequenced transcripts from inflorescences showed significant homology with genes of known function. Fourteen (14, 33.33%) out of 42 sequenced transcripts from leaves showed homology with genes of known function. ESTs and DD analysis showed that the expression patterns of tetraploid plants are closely related, whereas the expression of the diploid genotype was significantly different, showing that the expression profile, at least for a large number genes, depends on the ploidy level. This behavior in gene expression correla-tes well with the genetic and epigenetic structure of the series in classical and partial Mantel test. During the conver-sion tetraploid-diploid a significant proportion of genetic and epigenetic changes are produced that revert during the convertion diploid-tetraploid, suggesting that some loci have a particular sequence and / or a certain condition of methy-lation-dependent on the ploidy level. These genetic and epigenetic changes occur in a particular stage of expression that depends on the ploidy level. However, a particular group of genes showed a curious behavior. They were mainly silenced in the 2x sex and 4x apo genotypes. This group of genes was detected in both ESTs and DD analysis. Since 2x sex and 4x apo plants have different ploidy level and different reproductive mode, the expression pattern of these genes is intriguing. These candidate genes were called "unexpected". Most genes in this group are overexpressed in the 4x sex plant, while being repressed in the 4x apo and 2x sex genoty-pes. To explain the existence of this group of "unexpected" genes and the relationship that might have with apomixis and polyploidy, we suggest that to maintain active the sexual reproduction at the tetraploid level the activation of a gene cluster is required, and that this activation would be blocked (or silenced) in the 4x apo genotype, explaining the silenced group of genes found in these genotype. The candidates genes were in silico mapped onto the rice and maize chromosomes.