Mecanismos moleculares de protección en la retina

Abstract

En este trabajo de tesis nos concentramos en dos compo-nentes principales del sistema endógeno de defensa, impli-cados en el contexto de las enfermedades neurodegenerativas de la retina: la línea de defensa antioxidante, y las citoquinas de estrés. En el capitulo I, investigamos si los antioxidantes zeaxantina (ZEA), luteína (LUT), y β-caroteno (BC), los principales carotenoides de la dieta, protegen a los fotorre-ceptores del estrés oxidativo y si esa protección es sinérgica con la impartida por el ácido docosahexaenoico (DHA). Reali-zando cultivos neuronales puros de retinas de rata, encon-tramos que los pretratamientos con DHA, ZEA, LUT y BC redujeron la muerte de los fotorreceptores inducida por dos tipos de agentes oxidantes, paraquat (PQ) y peróxido de hi-drógeno (H2O2). Además de este efecto, ZEA y LUT incre-mentaron la diferenciación de los fotorreceptores, aumen-tando la expresión de opsina y promoviendo el desarrollo de procesos característicos de fotorreceptores maduros. Nues-tros resultados sugieren que las xantófilas ZEA y LUT junto al DHA podrían ser importantes factores ambientales que contri-buyen a la promoción de la supervivencia y diferenciación de los fotorreceptores. En el capitulo II, utilizamos los cultivos neuronales puros de retina de rata para estudiar el efecto protector directo de la neurocitoquina de estrés, el factor inhibidor de la leucemia (LIF), sobre fotorreceptores sujetos al estrés oxidativo inducido por PQ. Observamos que el pretrata-miento con LIF redujo la muerte celular y disminuyó la expresión de opsina en los cultivos, en una forma dependiente de la concentración. LIF activó la vía de señalización gp130/STAT3, lo que sugiere que este modelo es una poten-te herramienta para facilitar el estudio de los mecanismos que dirigen los efectos en la protección y en la diferenciación de LIF en los fotorreceptores de la retina. En el capítulo III investigamos mecanismos endógenos de neuroprotección de fotorreceptores in vivo en ratones usando un modelo de precondicionamiento con ciclos de luz/oscuridad (PC), seguido por exposición a daño agudo por luz (LD). Trabajos previos en el laboratorio del Dr. Ash demostraron que El PC induce la expresión de LIF y la activación de la vía gp130/STAT3. Aquí demostramos que el PC con luz moderada, previo al LD resultó en casi completa protección funcional y morfológica de los fotorreceptores. Estudiamos si el mecanismo de esta protección involucra la disminución en la acumulación de productos de oxidación. Hallamos que LD induce la oxidación de ADN en fotorreceptores. El PC previo redujo la oxidación de ADN como parte de la respuesta endógena de neuropro-tección inducida por este modelo. En el capítulo IV, investiga-mos si la activación de STAT3 inducida por LIF altera la actividad biológica de las células del epitelio pigmentado de la retina (RPE) in vivo. Generamos modelos de ratones knock-out para específicamente delecionar STAT3 o gp130 en el RPE, en la retina, o en ambos retina y RPE y realizamos inyecciones intravítreas de LIF en estos modelos. Establecimos que LIF regula negativamente la expresión y actividad de la isomerohidrolasa RPE65, componente clave del ciclo visual en el RPE, de manera coordinada con una reducción en la expresión de la rodopsina en los fotorreceptores, para disminuir la síntesis del fotopigmento visual. Dicha regulación se postula como neuroprotectora de la exposición al estrés por luz, o de enfermedades neurodegenerativas de la retina. Estos efectos en la retina y en el RPE fueron independientes y requirieron la activación de la vía de señalización gp130/STAT3 intrínseca de la retina y del RPE, respectivamente.

In this thesis, we focused on two main components of the endogenous defense system implicated in neurodegenerative diseases in the retina: the antioxidant line of defense and stress cytokines.In chapter I, we investigated whether the main carotenoids from the diet:zeaxantin (ZEA), lutein (LUT), and β-carotene (BC), protect photoreceptors from oxidative stress and whether this protection is synergis-tic with that given by docosahexaenoic acid (DHA). By per-forming pure neuronal cultures from rat retinas, we found that pretreatment with DHA, ZEA, LUT and BC reduced photo-receptor apoptotic cell death induced by two types of oxidants, paraquat (PQ) and hydrogen peroxide (H2O2).Also, ZEA and LUT increased the expression of opsin and promoted the development of processes that are characteristic of mature photoreceptors. Our results suggest that the xantho-phylls ZEA and LUT along with DHA could be important envi-ronmental cues contributing to the promotion of photore-ceptor survival and differentiation. In chapter II, we used pure neuronal cultures from rat retinas to study the direct effects of the stress neurocytokine, leukemia inhi-bitory factor (LIF), on photoreceptors exposed to oxidati-ve stress induced by PQ. We observed that pretreatment with LIF reduced photoreceptor cell death and decreased opsin expression in primary retinal neurons, in a dose-de-pendent manner. LIF activated the gp130/STAT3 signaling pathway, which suggests this model as a potent tool that could ease the study on mechanisms involved in the effects induced by LIF on photoreceptor survival and differentiation. In chapter III, we examined endogenous protective mechanisms of photoreceptor in 9 vivo, in mice exposed to a model of preconditioning with cycles of light/darkness (PC) followed by exposure to acute light damage (LD). Previous work in Dr. Ashs laboratory has demonstrated that the primary endogenous neuroprotective response in this model is the upregulation of LIF and increased gp130/STAT3 signaling in photoreceptors. Here, we demonstrated that PC with moderate levels of light prior to LD resulted in almost complete functional and morphological protection of photoreceptors. We studied whether the mechanism mediating this protection involved a reduction in the accumulations of oxidation products. We found that LD induced DNA oxidation in photoreceptors, but the prior treatment with PC decreased such oxidation as a part of the endogenous response induced by this model. In chapter IV, we aimed to investigate whether the activation of STAT3 induced by LIF alters the biological activities of the retinal pigmented epithelium (RPE) in vivo. We generated conditional knock-out mouse models with specific deletion of STAT3 or gp130 in the RPE, in the retina, or in both retina and RPE and we performed intravitreal injections of LIF in these animals. Our studies allowed us to establish that LIF downregulates the expression and activity of the isomerohydrolase RPE65, a key component in the visual cycle in the RPE, which is coordinated with a decrease in the expression of rhodopsin in photoreceptors, to diminish the synthesis of the visual photopigment. This coordinated downregulation is postulated to be neuroprotective in both light stress and in neurodegenerative diseases in the retina. The effects induced by LIF in the retina and the RPE were independent from each other and required the activation of the gp130/STAT3 signaling pathway intrinsic to retina and RPE, respectively.