Contribución al conocimiento de la taxonomía y del modo reproductivo del pasto llorón Eragrostis curvula (Scharad.) Nees

Abstract

El pasto llorón, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees, es una gramínea perenne de origen sudafricano que se ha convertido en una de las más importantes fuentes de alimentación del ganado en las áreas subhúmedas y semiáridas de nuestro país. Constituye un grupo botánico muy polimórfico por lo que en numerosas oportunidades se hace referencia a esta especie como el complejo E. curvula. Este complejo es morfológicamente diverso, pobremente conocido y no bien circunscrito. Si bien existen diferencias morfológicas marcadas entre las variedades de esta gramínea, la existencia de formas o ecotipos con características intermedias entre ellas dificulta la clasificación. E. curvula incluye genotipos de diferente ploidía. Los diploides (2n=2x=20) son raros en la naturaleza, se reproducen sexualmente y son autoincompatibles, mientras que los poliploides (2n=6x=60 a 2n=8x=80) se reproducen por apomixis y son autocompatibles. También existen unos pocos facultativos. El término apomixis hace referencia a una forma de reproducción asexual a través de semillas que origina plantas genéticamente idénticas a la planta madre (clones). Estas semillas se forman a partir de tejidos maternos del óvulo, evitando los procesos de meiosis y fertilización. El pasto llorón presenta apomixis diplospórica y la polinización es necesaria para la formación de la semilla (pseudogamia). En el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del CERZOS-CONICET-UNS se obtuvo por cultivo in vitro de inflorescencias de pasto llorón una planta diploide (UNST1122). Semillas de esta planta fueron tratadas con colchicina y se obtuvieron dos plantas tetraploides (colchiploides) con alto grado de sexualidad (UNST1112 y UNST1131). Esta serie de plantas permite estudiar tanto variaciones producidas por cambio de ploidía como por cambios en el modo reproductivo. Por otro lado, la disponibilidad de plantas tetraploides sexuales posibilita el cruzamiento de las mismas, como madres, con polinizadores apomícticos, de manera de obtener poblaciones de mapeo que segreguen para el carácter y de esta forma realizar un mapa genético y ubicar regiones genómicas asociadas al modo reproductivo. Por lo tanto los objetivos de la presente tesis fueron: 1) analizar la variabilidad existente en el germoplasma nacional de pasto llorón, a fin de seleccionar los genotipos apropiados para desarrollar una población segregante para la apomixis; 2) estudiar el modo reproductivo de la especie; 3) construir un mapa genético a nivel tetraploide utilizando una población segregante para el modo reproductivo y 4) localizar regiones genómicas asociadas a la apomixis. Se utilizó una colección de germoplasma (ocho cultivares comerciales) proveniente del INTA (EEA Anguil, La Pampa) que representan los más difundidos en Argentina y algunos desarrollados en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal (CERZOS, UNS). Se utilizaron marcadores RAPDs y AFLPs y se desarrollaron marcadores SSRs a partir de genotecas de ADNc de E. curvula. La información obtenida permite concluir que los datos aportados por marcadores moleculares se ajustan a los datos previos citológicos y quimiosistemáticos y el agrupamiento de los distintos materiales corresponde a los distintos tipos agronómicos. Los donantes de polen más adecuados para la obtención de una población de mapeo serían los cvs. Morpa, Ermelo y Don Arturo. Para la evaluación del modo reproductivo se analizaron diferentes técnicas, de manera de contar con un test rápido y preciso para la caracterización de la población de mapeo. Se realizaron estudios citoembriológicos de sacos embrionarios (con distintas tinciones), pruebas de progenie con marcadores moleculares y análisis de ploidía en semillas con citometría de flujo. Las pruebas de progenie utilizando marcadores RAPDs y el patrón de deposición de calosa simplifican el análisis y agilizan el proceso de caracterización fenotípica. Con citometría de flujo se confirmó que la relación de ploidías entre embrión/endosperma en la semilla no se modifica en los procesos apomícticos con respecto a los sexuales, por lo que esta técnica no serviría para la caracterización del modo reproductivo. Esto hace al sistema Eragrostis atractivo para la transferencia de la apomixis a los cereales, que son sumamente sensibles a los cambios en la relación de ploidía embrión/endosperma. La observación de calosa en la megasporogénesis de plantas apomícticas cuestiona observaciones realizadas previamente. Se realizaron cruzamientos entre los colchiploides y los cvs. tetraploides apomícticos Morpa y Ermelo, cuatro años luego de la poliploidización de los colchiploides. Al analizar la segregación de marcadores en la progenie se observó que esta presentaba una alta homología con el progenitor femenino, característica de la reproducción apomíctica. Por tal razón se realizaron test de deposición de calosa y pruebas de progenie en las plantas UNST1131 y UNST1112, demostrando que actualmente presentan un 10-20% de reproducción sexual, en lugar del 100% hallado en los estudios realizados en el año 2003. La siguiente etapa del trabajo de tesis tuvo como objetivo comprobar si durante el periodo 2003-2007 se produjeron alteraciones de tipo genético (análisis de AFLPs) y/o epigenético (análisis de MSAP) en las plantas UNST1131 y UNST1112, a fin de explicar la reducción en la expresión de la sexualidad. Estos análisis revelaron cambios genéticos y epigenéticos en el tiempo en estas plantas, indicando cierta plasticidad genómica. Se secuenciaron bandas polimórficas, algunas de las cuales mostraron homología con secuencias repetitivas y con marcadores de apomixis. También se estudió la actividad de retrotransposones en las genotecas de E. curvula disponibles para estimar la posibilidad de mutaciones y reestructuraciones epigenéticas dirigidas por estos elementos. Los resultados de este análisis indican que en la genoteca de inflorescencias de la planta Tanganyika (tetraploide apomíctica) existe un porcentaje menor de secuencias similares a retrotransposones transcripcionalmente activos en comparación con las genotecas de inflorescencias de las plantas UNST1122 (diploide sexual) y UNST1131 (tetraploide altamente sexual, ya que las genotecas se realizaron en el año 2003). La mayor actividad de retrotransposones observada en las plantas sexuales podría deberse a las situaciones de estrés por las que pasaron durante el cultivo in vitro y posterior tratamiento de poliploidización. De todo lo expuesto se concluyó que las plantas diploides de E. curvula son completamente sexuales. Las plantas de mayor nivel de ploidía son, en general altamente apomícticas. Algunas plantas tetraploides pueden presentar sexualidad en alto grado, como las colchiploides recientes. Otras son completamente sexuales, como el material PI 574506 del USDA. Estas evidencias indicarían la existencia de una región (o dos) determinantes del carácter apomixis. Esta/s región/es estaría/n ausente/s en las tetraploides completamente sexuales. Las plantas apomícticas pueden desreprimir la sexualidad ante situaciones que provoquen choques genómicos, indicando un control epigenético del carácter. La/s región/nes también estarían presentes en la planta diploide de la serie euploide, pero no se expresa. Una hipótesis para explicar este fenómeno podría basarse en los mecanismos de silenciamiento que existen en las plantas dependientes del número de copias de ciertos genes.

Weeping lovegrass, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees is a perennial grass native from Southern Africa that has become one of the most important forage crops in the subhumid and semiarid areas of Argentina. It constitutes a highly polymorphic group so many times referred as the E. curvula complex. This complex is morphologically diverse, poorly understood and not very well circumscribed. E. curvula includes genotypes with different ploidy. Diploids (2n = 2x = 20) are rare in nature, reproducing sexually and are self-incompatible, while the polyploids (2n = 6x = 60 to 2n = 8x = 80) are self-compatible and reproduce by apomixis. There are also a few facultative cytotypes. The term apomixis refers to a form of asexual reproduction through seeds that give origin to plants genetically identical to the mother plants (clones). These seeds are formed from maternal tissues of the ovule, preventing the meiosis and fertilization process. Weeping lovegrass presents diplosporous apomixis and pollination is necessary for seed formation (pseudogamia). In the Plant Biotechnology Laboratory CERZOS-CONICET-UNS a diploid plant of weeping lovegrass (UNST1122) was obtained by in vitro culture of inflorescences. Seeds of this plant were treated with colchicine and two tetraploid plants (colchiploid plants) were obtained with a high degree of sexuality (UNST1112 and UNST1131). This series allowed the study of variations produced by changes of ploidy and/or by the reproductive mode. Moreover, the availability of sexual tetraploid plants enables the crossing of them, as mothers, with apomictic pollinators to obtain mapping populations segregating for the reproductive mode. This make possible the construction of a genetic map where to locate genomic regions associated with apomixis. Therefore the objectives of this thesis were: 1) to analyze the variability in the weeping lovegrass local germplasm in order to select genotypes for a mapping population segregating for apomixis; 2) to study the reproductive mode of the species; 3) to construct a genetic map at tetraploid level and 4) to identify genomic regions associated with apomixis. A collection of germplasm (eight cultivars) from INTA (EEA Anguil, La Pampa) was used, which represent the most widespread cultivars used in Argentina and some developed in the Plant Biotechnology Laboratory (CERZOS, UNS). AFLPs and RAPDs markers were used and SSRs markers were developed from cDNA libraries of E. curvula. The information obtained suggests that the data provided by molecular markers is consistent with previous classifications based on cytological, chemosystematics and agronomic data. Pollen donors suitable for obtaining the mapping population would be the cvs. Morpa, Ermelo or Don Arturo. The reproductive mode was analyzed using different techniques, looking for a quick and accurate test for the characterization of the mapping population. Cytoembryological studies of embryo sacs (with different staining techniques), progeny tests with molecular marker and flow cytometry seed screen were performed. The progeny tests using RAPDs markers and callose deposition simplify and expedite the phenotypic characterization. Flow cytometry confirmed that the ploidy relationship between embryo/endosperm in the seed is not modified in apomictic with regard to sexual processes, so this technique is not useful for the characterization of the reproductive mode. This fact makes the system very attractive in the light of future transfer of the trait to cereals, that are very sensitive to changes in the embryo/endosperm ploidy relations. Callose was observed in apomictic plants, questioned previous results of other authors. Crosses were made between the colchiploid plants and the apomictic tetraploid cvs. Morpa and Ermelo. These crosses were done four years after obtaining the colchiploid plants. A preliminary progeny test showed a high homology with the mother plant, characteristic of apomictic reproduction. For this reason colchiploid plants were analyzed using callose and progeny tests. These studies showed 10-20% of sexual reproduction, instead of the 100% found in previous studies conducted immediately after polyploidization. The next stage of the thesis aimed to verify whether during the 2003-2007 period there were genetic (AFLPs analysis) and/or epigenetic alterations (MSAP analysis) in the colchiploid plants and the original one, from cv. Tanganyika. These studies had the objective to explain the reduction in the expression of sexual reproduction. These analyses revealed genetic and epigenetic changes over time, indicating some genomic plasticity. Polymorphic bands were sequenced, and some of them showed homology with repetitive elements and apomixis markers. Studies of retrotransposons activity in the E. curvula libraries were performed to estimate the possibility of mutations and epigenetic restructuring directed by these elements. Results indicate that the library from inflorescences of Tanganyika (apomictic tetraploid) have the lowest percentage of sequences similar to retrotransposons compared to the libraries of UNST1122 (sexual diploid) and UNST1131 (highly sexual tetraploid, since the library was performed in 2003). The increased activity of retrotransposons observed in sexual plants could be due to stressful situations occurred during in vitro culture and subsequent colchicine treatment. From the foregoing it was concluded that the diploid plants of E. curvula are fully sexual. Plants of higher ploidy are generally highly apomictic. Tetraploid plants can be highly sexual, such as UNST1131 and UNST1112 (colchiploids) immediately after polyploidization. Others are completely sexual such as PI 574506 cytotype from USDA. These evidences indicate the existence of one or two regions controlling apomixis (based on previous results). This region is absent in fully sexual tetraploids. Apomictic plants can un-repress sexuality under genomic stress situations, indicating an epigenetic control of the trait. The apomicts region/s is/are also present in the diploid plant UNST1122, but is not expressed. One hypothesis to explain this phenomenon could be based on silencing mechanisms dependent on the number of copies of certain genes.