Caracterización del mecanismo de endocitosis del AChR expresado en células CHO-K1/A5 y su modulación por el colesterol

Abstract

El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es un canal iónico de la familia de canales iónicos activados por ligando (LGIC) que está presente en el sistema nervioso central y en la unión neuromuscular (UNM). Su estabilidad en la membrana celular es importante, ya que determina el nivel de respuesta colinérgica y puede ser alterada ante diversas situaciones fisiológicas y patológicas. Se ha propuesto que la endocitosis del AChR es el mecanismo más importante de neuromodulación de la UNM y de sinapsis centrales, tanto en condiciones fisiológicas como en diversas patologías. En este trabajo estudiamos la endocitosis del AChR heterólogamente expresado en células CHO-K1. Demostramos que la unión del antagonista competitivo α-bungarotoxina (αBTX) o el entrecruzamiento con anticuerpos induce la internalización de los AChR de la superficie celular. Este proceso ocurre en dos etapas: primero los complejos AChR-αBTX son secuestrados en un compartimiento tubular conectado con la superficie, como lo demuestra la diferente accesibilidad de la αBTX fluorescente unida al AChR a sondas de alto y bajo peso molecular. Subsecuentemente el AChR es internalizado a través de un mecanismo independiente de clatrina, de dinamina y de caveolina. La desorganización de la actina inhibe estos dos procesos, lo que indica que ambos requieren la integridad del citoesqueleto. La función del AChR depende de la composición de los lípidos que lo rodean en la membrana y entre éstos el colesterol (Col) parece ser necesario para mantener la estructura del AChR (revisión en Barrantes, 2007). El Col también es necesario para la formación y estabilización de los agregados del AChR en la membrana de células C2C12. Debido a la importancia de este lípido sobre distintos aspectos del AChR estudiamos su influencia en la estabilidad del receptor en la membrana de las células CHO-K1/A5. Descubrimos que la depleción de Col (Col-) mediada por ciclodextrinas acelera la internalización del AChR en una forma dependiente de la dosis (Borroni et al., 2007). Experimentos realizados con una proteína dominante negativa de dinamina (dinK44AHA) y una forma truncada de Eps15 (Eps15 95G295) indicaron que la internalización del AChR en células Col- es independiente de clatrina y de dinamina. El bloqueo de la funcionalidad de la GTPasa Arf6 por la expresión de una versión dominante negativa de dicha proteína (Arf6 T27N-HA) demostró que la depleción de Col vuelve la internalización del AChR sensible a la actividad de Arf6. La inhibición de la formación de ácido fosfatídico con alcoholes primarios también disminuyó la endocitosis del AChR en células Col- indicando la importancia de este lípido. Al igual que en células con niveles normales de Col, la internalización del AChR en células Col- depende de la actividad de la pequeña GTPasa Rac1. Sin embargo, ni el secuestro del PI4,5P2 a través de la sobre expresión de la proteína de fusión del dominio PH de la fosfolipasa Cδ, PH-PLCδ-GFP, ni la desorganización del citoesqueleto a través de agentes farmacológicos afectaron la internalización del AChR en condiciones de depleción de Col celular. Estos resultados resaltan la importancia del Col como modulador de la estabilidad del AChR en la membrana.

The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is an integral membrane protein belonging to the superfamily of the ligand-gated ion channel. present at the neuromuscular junction and central nervous synapses. Its stability at the cell membrane is important in determining cholinergic responses and can be altered under pathological conditions. El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es una proteína integral de membrana de la superfamilia de canales iónicos activados por ligando (LGIC). Está presente en el sistema nervioso central y en la unión neuromuscular (UNM). Su estabilidad en la membrana celular es importante, ya que determina el nivel de respuesta colinérgica y puede ser alterada ante diversas situaciones fisiológicas y patológicas. Endocytosis of the AChR is proposed to be a major mechanism of neuromodulation at neuromuscular junctions and in the pathology of synapses in the central nervous system. Here we have studied the endocytosis of AChR heterologously in CHO-K1 fibroblasts. Binding of the competitive antagonist α-bungarotoxin (αBTX) or antibody-mediated crosslinking induces the internalization of cell-surface AChR to late endosomes. Internalization occurs via sequestration of AChR-αBTX complexes in narrow, tubular, surface-connected compartments, as indicated by differential surfaceaccessibility of fluorescently-tagged αBTX-AChR complexes to small and large molecules. Internalization takes place by a clathrin and caveolin-independent pathway, and does not require the function of dynamin. However the integrity of the actin cytoskeleton is required for AChR sequestration and internalization since perturbation of actin polymerization inhibits these processes. This pathway resembles a recently elucidated dynamin-independent internalization mechanism employed for downregulation of long-term resident plasma membrane proteins, and may provide insights into AChR dynamics at ligand-gated synapses and in pathological conditions such as the autoimmune disease mysthenia gravis.