Estudio de las vías de transducción de la señal del 17ß-estradiol en células musculares esqueléticas : cascadas MAPKs

Abstract

Las cascadas de señalización de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) son estimuladas por el 17 # estradiol en diferentes tipos celulares; sin embargo, la modulación de las MAPKs por esta hormona y su rol fisiológico en células musculares esqueléticas no han sido aún estudiados. En este trabajo de tesis se investigaron las acciones del 17 # estradiol sobre las vías ERK1/2 y p38 MAPK así como su participación en los efectos antiapoptóticos del estrógeno, en la línea celular de músculo esquelético murino C2C12 en estado proliferativo. Los resultados obtenidos muestran que el 17 # estradiol induce una activación máxima de ERK2 y p38 MAPK a una concentración de 10 8 M durante 15 minutos. Bajo estas condiciones, la hormona estimuló la fosforilación de los factores de transcripción CREB y Elk1 y aumentó los niveles proteicos de cFos y cJun. La preincubación de las células con los inhibidores de ERK1/2 (U0126) y p38 MAPK (SB203580), reveló que la fosforilación de CREB, Elk1 y el incremento de cFos y cJun inducidos por el estrógeno son dependientes de ambas MAPKs. Asimismo, los inhibidores de las familias Src (PP2) y PKC (Ro318220) suprimieron la activación de ERK2, p38 MAPK, CREB y Elk1 así como la expresión de cFos y cJun en respuesta al estrógeno, indicando que PKC y Src participan upstre am en la fosforilación de ERK2 y p38 MAPK por el 17 ß estradiol. También, se evidenció que la hormona promueve la activación de Src en forma dependiente de PKC. Además, el uso de ICI182780, un antagonista de los receptores estrogénicos, y siRNAs específicos que bloquearon la expresión de los mismos, demostraron que ER a media la activación de ERK2 por el 17 ß estradiol sin afectar el estímulo de la hormona sobre la fosforilación de p38 MAPK. Adicionalmente, el uso del E2BSA, el cual no ingresa al interior celular, demostró que, en la fosforilación de ambas MAPKs por el estrógeno, no están involucrados receptores localizados en la membrana plasmática. Posteriormente, se profundizó sobre las acciones protectivas del 17 ß estradiol en células musculares observadas previamente en nuestro laboratorio. Los resultados obtenidos con cultivos de células C2C12 expuestos al H2O2 mostraron cambios morfológicos en las mitocondrias, núcleos y citoesqueleto, desfosfosforilación de Akt y Bad, pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial, liberación de Smac/DIABLO, clivaje de la procaspasa3 y de PARP. El pretratamiento de las células con la hormona revirtió estos eventos excepto cuando fueron preincubadas con los inhibidores de ERK1/2 (U0126) y p38 MAPK (SB203580), sugiriendo un rol clave de ambas MAPKs en los efectos antiapoptóticos del estrógeno. Adicionalmente, estudios de inmunocitoquímica y fraccionamiento subcelular sugieren que la hormona induce la translocación de ERK2 activa a mitocondrias, organelas relacionadas con el proceso apoptótico. En su conjunto, los resultados presentados en este trabajo de tesis, muestran que el 17 # estradiol en células musculares esqueléticas, induce la activación de las vías ERK2 y p38 MAPK, involucrando a dichas quinasas en la inducción de cFos y cJun, y en la acción protectiva del estrógeno. La información obtenida contribuye al conocimiento de la regulación endócrina del metabolismo muscular en estados fisiológicos y patológicos.

The signaling cascades of mitogen activated protein kinases (MAPKs) are stimulated by 17ßestradiol in different cellular types. However, the modulation of MAPKs by this hormone and its physiological function in skeletal muscle cells have not been studied yet. In this thesis, the role of 17ß estradiol mediated activation of ERK1/2 and p38 MAPK on early gene expression and antiapoptotic effects of the estrogen were investigated in the murine skeletal muscle cell line C2C12 in proliferative state. Initially, results showed that 17ßestradiol induces a maximal activation of ERK2 and p38 MAPK in C2C12 muscle cells at a concentration of 10 8 M during 15 minutes. Under these conditions, the hormone promoted the phosphorylation of CREB and Elk1 transcription factors and increased cFos and cJun protein levels. Preincubation of the cells with ERK1/2 inhibitor (U0126) and p38 MAPK inhibitor (SB203580) revealed that CREB and Elk1 phosphorylation and the increase of cFos and cJun induced by the estrogen were dependent of both MAPKs. In addition, inhibitors of Src family (PP2) and PKC family (Ro318220) suppressed the activation of ERK2, p38 MAPK, CREB and Elk1 as well as the expression of cFos and cJun, indicating that PKC and Src participate upstream in ERK2 and p38 MAPK phosphorylation by 17ßestradiol. Also, the hormone induced Src activation in a PKCdependent manner. Furthermore, the use of ICI182780, an antagonist of the estrogen receptors, and specific siRNAs that blocked expression of ERs demonstrated that ER a mediates ERK2 activation by 17ß estradiol without affecting the stimulus of the hormone on p38 MAPK phosphorylation. Moreover, the use of E2BSA, which does not enter into the cellular interior, demonstrated that activation of both MAPKs by the estrogen was not dependent on receptors localized at plasmatic membrane level. The protective actions of 17 ß estradiol in muscle cells previously observed in our laboratory were characterized in more depth. The results obtained show that cultures exposed to H2O2 present morphological changes of mitochondria, nucleus and cytoskeleton, Akt and Bad dephosphorylation, loss in mitochondrial membrane integrity, Smac/DIABLO release, and procaspase3 and PARP cleavage. Pretreatment of the cells with the hormone reverted these events, except when C2C12 cells were preincubated with ERK1/2 inhibitor (U0126) and p38 MAPK inhibitor (SB203580), suggesting a key role of both MAPKs in the antiapoptotic effects of the estrogen. Additionally, immunocytochemistry and subcellular fractionation studies suggest that 17 ß estradiol induces translocation of activated ERK2 into mitochondria, organelles related to the apoptotic process. Altogether, the results of this thesis show that through the activation of the ERK2 and p38 MAPK cascades, 17 # estradiol induces the expression of early protooncogenes and exerts a protective action in skeletal muscle cells. These data contribute to the knowledge of endocrine regulation of muscle metabolism in physiological and pathological states.