Modulación por agonistas purinérgicos de la concentración de calcio intracelular y vías de señalización relacionadas con proliferación en células tumorales de mama

Abstract

El ATP es una molécula de señalización potente que, actuando a través de receptores P2 ó purinérgicos ubicados en la membrana plasmática, modula funciones biológicas importantes en diversos tipos celulares. En el presente trabajo de tesis se investigó la modulación por ATP de la concentración de calcio intracelular ([Ca2+]i), las cascadas de señalización de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), la vía fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K)/Akt, y su interrelación en células tumorales de mama (línea MCF-7). Los resultados demuestran que el ATP aumenta la [Ca2+]i por liberación del catión desde depósitos intracelulares sensibles a inositol trifosfato (IP3) involucrando a la fosfolipasa C (PLC). Además, se observó un influjo transitorio de calcio sensible a gadolinio y lantano, producido por la adición de vehículo posterior a la estimulación purinérgica, al que se denominó influjo SAC (por stress activated calcium influx). Se comprobó que el ATP estimula la fosforilación de las MAPKs ERK1/2, p38 y p46 JNK en forma dependiente de la dosis y tiempo de tratamiento, y de p54 JNK con un perfil diferente al observado para las otras MAPKs. La fosforilación de MAPKs mostró involucrar la vía PI-PLC/IP3/Ca2+ y la proteína quinasa C (PKC), pero resultó independiente del calcio extracelular y de la tirosina quinasa Src. También se comprobó que el ATP estimula la expresión del factor de transcripción c-Fos y la fosforilación de los factores ATF1, c-Jun y JunD en células MCF-7. Se estableció la participación de las MAPKs solamente en la inducción de c-Fos y en la fosforilación de c-Jun y JunD por ATP. Adicionalmente, se demostró que el ATP promueve, en forma dependiente de PKC, la fosforilación de la familia de tirosina quinasas Src en tirosina 416 y la fosforilación de Akt en serina. A diferencia de lo observado para las MAPKs, Src participó en la fosforilación de Akt inducida por ATP. Igualmente, PI3K medió la estimulación por ATP de la fosforilación de Akt y no la de MAPKs. La caracterización farmacológica realizada en base al empleo de agonistas de distintos subtipos de receptores P2Y, en conjunto con estudios de RT-PCR, sustentan la expresión de receptores P2Y2 y P2Y4. Los resultados presentados en este trabajo de tesis contribuyen al conocimiento de los mecanismos de transducción de señales de nucleótidos extracelulares, particularmente del ATP, en células mamarias tumorales.

ATP is a powerful signaling molecule that, acting through membrane bound P2 receptors, modulates important cellular functions of different cellular types. In the present work we investigated ATP modulation of intracellular calcium concentration ([Ca2+]i), mitogenactivated protein kinases (MAPKs) and phosphatidyl inositol 3 kinase/Akt (PI3K/Akt) signaling pathways and their relationship in MCF-7 breast cancer cells. The results show that ATP increases [Ca2+]i due to cation release from IP3-sensitive intracellular stores involving phospholipase C (PLC) activation. In addition, we observed a transient calcium influx sensitive to gadolinium and lanthanum, induced by the addition of vehicle after purinergic activation, named stress activated calcium influx (SAC influx). ATP stimulated the phosphorylation of the MAPKs ERK1/2, p38 and p46 JNK in a time and dose dependent manner, and also induced the phosphorylation of p54 JNK with a different profile when compared with other members of this family of kinases. The phosphorylation of MAPKs by ATP was dependent both on the PI-PLC/IP3/Ca2+ pathway and protein kinase C (PKC) but independent of Src kinase and of calcium influx from extracellular space. In addition, ATP induced the expression of the transcription factor c-Fos and the phosphorylation of ATF1, c-Jun and JunD transcription factors in MCF-7 cells. The participation of the MAPKs in c-Fos induction and in c-Jun and JunD phosphorylation by ATP was established. Moreover, ATP induced the phosphorylation, in a PKC dependent manner, of Src at its tyrosine 416 and of Akt at serine. Opposite to what we previously saw for MAPKs, Src participated in the phosphorylation of Akt by ATP. Accordingly, PI3K participated in the phosphorylation of Akt but not in the phosphorylation of MAPKs by ATP. Pharmacological characterization by the use of different purinergic agonists together with RT-PCR studies supported the expression of P2Y2 and P2Y4 receptor subtypes. The results presented here help to understand the mechanisms and signal transduction pathways activated by extracellular nucleotides, particularly ATP, in breast tumor cells.