Lípidos neutros y polares con ácidos grasos poliinsaturados de las series n-6 y n-9 en el tracto reproductor masculino de rata

Abstract

En los tejidos de mamífero los glicerofosfolípidos (GPL) se presentan en tres subclases dependiendo de si la cadena hidrofóbica que se une a la posición sn-1 del esqueleto de glicerol es un ácido graso, un alcohol graso, o un aldehído graso unidos a través de una unión éster, 1-O-alquil-éter, o 1-alc-1’enil-éter, respectivamente, estando la posición sn-2 ocupada por un ácido graso (las subclases fosfatidil-, plasmanil- o plasmenil- de GPL respectivamente). En la clase triglicéridos (TG) es posible encontrar subclases similares: los bien conocidos triacilgliceroles (TAG), con tres ácidos grasos esterificados al glicerol, y los TG con una unión éter (TUE), esto es, un alcohol graso o un aldehído graso en la posición sn-1 del glicerol y ácidos grasos en las posiciones sn-2 y sn-3 del glicerol (1-O-alquil- y 1-O-alc-1’-enil-, 2,3-diacil-sngliceroles, aquí abreviados como alquil-DAG y alquenil-DAG, respectivamente). En general es escaso y fragmentario el conocimiento actual sobre las características de las subclases individuales de GPL y de TG, y cómo se relacionan entre sí en células y tejidos animales, especialmente en lo que concierne a los TUE. El objetivo de este trabajo de tesis fue el de reunir información sobre la bioquímica de estas subclases, abarcando aspectos de su contenido y composición en distintas áreas del sistema reproductor masculino. Tomando a la rata como modelo, en el testículo y en el epidídimo se estudiaron los cambios de estas subclases durante el desarrollo postnatal y, en el adulto, los efectos que sobre ellas produce el estrés térmico. En espermatozoides se determinó la distribución entre la cabeza y la cola de las subclases de GPL, y los efectos que sobre estas últimas ejercen la capacitación y la reacción acrosomal inducidas in vitro. Durante el desarrollo postnatal, en el testículo aumentaron los contenidos de todas las subclases de GPL de colina y de etanolamina (CGP y EGP, respectivamente), que se enriquecieron en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de 20 y 24 carbonos. En función de la edad postnatal, en ellas disminuyó la proporción de ácido araquidónico (20:4n-6) y aumentó notoriamente la de ácido docosapentaenoico (22:5n-6). En el adulto los dos plasmalógenos, en especial la plasmeniletanolamina, fueron muy ricos en 22:5n-6. Un cambio en el mismo sentido se produjo durante la diferenciación celular desde espermatocitos en paquiteno a espermátidas redondas, con una relación entre 22:5n-6 y 20:4n-6 cercana a 1 en fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, y muy superior a 1 en los correspondientes plasmalógenos, en especial plasmeniletanolamina. Ambas células espermatogénicas contuvieron los 1-O-alquil GPL plasmanilcolina y plasmaniletanolamina, la primera potencial precursora del lípido bioactivo PAF y la segunda precursora de la abundante plasmeniletanolamina. Los TUE sufrieron incrementos en su concentración por gramo de tejido en dos etapas clave de la primera onda de espermatogénesis: los días postnatales 21 y 45 (PN 21 y PN45), en los que se sabe que un número importante de los primeros espermatocitos primarios y de las primeras espermátidas, respectivamente, mueren por apoptosis. La exposición transitoria e intermitente de los testículos a la hipertermia (15 min a 43 ºC, una vez por día durante 5 días consecutivos) llevó a la pérdida selectiva de espermatocitos primarios y espermátidas jóvenes durante las primeras 1-2 semanas después del tratamiento, recomenzando luego la espermatogénesis a partir de las espermatogonias supervivientes. En este lapso, disminuyeron tanto las células como sus subclases lipídicas características, recuperándose ambas luego con la recuperación de la espermatogénesis. Las especies de los GPL de colina y de etanolamina ricas en 20:4n-6 reaparecieron antes que las ricas en 22:5n-6, a semejanza de lo que ocurrió en el desarrollo normal, pues primero reaparecieron los espermatocitos y luego las espermátidas. Durante las primeras semanas posttratamiento, cuando los túbulos seminíferos exhibieron una gran pérdida de células germinales con supervivencia de las células de Sertoli, sobre todo en la primera y segunda semanas, los niveles de TAG y de TUE, así como de ésteres de colesterol, aumentaron varias veces, para volver a disminuir luego. Atribuimos este aumento transitorio a la actividad fagocítica de las células de Sertoli. En el tejido epididimal normal del animal adulto estuvieron presentes las tres subclases de GPL. Con respecto a los lípidos neutros, además de grandes cantidades de TAG, se hallaron las dos subclases de TUE, alquil-DAG y alquenil-DAG, en cantidades mayores que el tejido testicular. En ambos tejidos los primeros predominaron sobre los segundos. Otra diferencia notable fue que en los lípidos del tejido epididimal coexistieron PUFA de 20 y 22 carbonos de las series n-6 (20:4n-6, 22:5n-6) y n-9 (22:3n-9, 22:4n-9). Al día postnatal 30, aún con escasa diferenciación y sin espermatozoides en sus conductos, el epidídimo contenía niveles de plasmeniletanolamina con niveles de PUFA n-9 más altos que las demás subclases. Con el avance del desarrollo, estos PUFA se incrementaron en las demás subclases, primero en la fosfatidilcolina (P49- P55) y luego en la plasmanil y en la plasmenicolina (P55-adultez). Por su parte los TUE epididimales se incrementaron notablemente el día posnatal 49, en coincidencia con el hecho de que poco antes (P45) había llegado a su lumen una oleada transitoria de células germinales desde el testículo, que en pocos días fueron reemplazadas por los primeros espermatozoides. Dado que los espermatozoides de rata se enriquecen progresivamente en plasmenilcolina con 22:4n-9 a medida que maduran en el epidídimo, esperábamos encontrarla en mayor concentración en alguno de los segmentos epididimales. Sin embargo, en las tres regiones epididimales el porcentaje de plasmeniletanolamina fue mayor que el de plasmenilcolina. La pequeña región del corpus fue la que exhibió la más alta concentración (μg por gramo de tejido) de plasmeniletanolamina y de su precursora la plasmaniletanolamina, además de alquil-DAG y alquenil-DAG, todos ellos ricos en PUFA n-9. La plasmeniletanolamina del corpus podría ser la precursora de la plasmenilcolina y ésta ser transferida a los espermatozoides en tránsito. Los mecanismos involucrados deben aún establecerse. Los efectos de la hipertermia sobre el epidídimo fueron muy distintos de los descritos en el testículo. Los conductos epididimales se vaciaron progresivamente de los espermatozoides que contenían inicialmente en el lapso de unas seis semanas posttratamiento, lo que concordó con el hecho de que los lípidos epididimales se empobrecieron en 22:5n-6 y que la plasmenicolina con 22:4n-9 de la cauda disminuyó. Sin embargo, los niveles de fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, y los correspondientes plasmalógenos, sobre todo en el caput se incrementaron sobre los niveles de los controles no tratados durante el mismo período. Llamativamente, los contenidos por gramo de tejido, tanto alquenil-DAG como alquil- DAG, se incrementaron agudamente en las tres regiones del epidídimo (caput, corpus, cauda) durante la primera semana post-hipertermia, y habían bajado nuevamente a la semana 2, con una divergencia interesante: en el caso de las especies con PUFA n-6, continuaron bajando, pero en el caso de las especies con 18:1n-9 y PUFA n-9 del caput, volvieron a incrementarse hacia la semana 6. Dado que el tejido testicular en este momento (día 42 post-hipertermia) estaba en vías de recuperación, este incremento podría reflejar una reacción celular específica de las células epididimales. Entre estas, merecen investigarse algunas células del sistema mononuclear fagocítico (células dendríticas, macrófagos), que están normalmente presentes en el compartimiento basal del epitelio epididimal, especialmente en el segmento inicial del caput. En el animal adulto en condiciones fisiológicas, la expresión (mRNA) de la alquilgliceronafosfato sintasa (AGPS), una enzima peroxisomal clave involucrada en la síntesis de lípidos con uniones éteres, fue significativamente menor en el testículo que en el epidídimo. En este último, la AGPS se expresó más activamente en el corpus que en caput y en éste más que en la cauda. Esto demostró la importancia de los dos primeros segmentos del epidídimo en la biosíntesis de lípidos con uniones éteres. Inmediatamente después del último de los 5 episodios de hipertermia aplicados, en el testículo se detuvo temporariamente la expresión de AGPS, mientras que en el epidídimo no. En contraste, a la semana 2 post-hipertermia el nivel de mRNA de la enzima en el testículo se había recuperado, mientras en el epidídimo se había reducido, tanto en el caput como en el corpus. Estos resultados sugieren que en el epidídimo la presencia de espermatozoides en el lumen es importante para que las enzimas involucradas en la biosíntesis de lípidos con una unión éter se expresen en las células del epitelio. En la primera parte del tercer capítulo se determinó la distribución entre la cabeza y la cola espermáticas de las subclases de los GPL de colina y de etanolamina. Un hallazgo original fue que la cabeza espermática, pese a su pequeño tamaño, concentró una proporción mayor de la plasmenilcolina total rica en 22:4n-9 que la cola. La cola a su vez contuvo más fosfatidiletanolamina rica en 20:4n-6 y 22:5n-6 y fosfatidilcolina rica en 22:5n-6, que la cabeza. Llamó la atención además que la cola contuviera plasmanilcolina y plasmaniletanolamina muy ricas en PUFA n-6. En la segunda parte de este capítulo se investigó la participación de las cuatro subclases principales de GPL del espermatozoide en la capacitación y la reacción acrosomal. Con respecto a controles no incubados, se produjeron hidrólisis de GPL de intensidad creciente en el siguiente orden: controles incubados sin agregados, gametas capacitadas, y gametas capacitadas que sufrieron la reacción acrosomal. Tal hidrólisis fue selectiva, pues afectó con intensidad creciente, en ese mismo orden, a las subclases fosfatidilcolina y fosfatidietanolamina. Por lo tanto estos eventos, importantes para la función de los espermatozoides, resultaron en un enriquecimiento relativo de las gametas en plasmalógenos. Los resultados de esta tesis abrieron nuevos interrogantes que serán objeto de futuros estudios sobre el rol biológico, propiedades, biosíntesis y catabolismo de los GPL y TG con una unión éter en células del tracto reproductor.

In mammalian tissues, glycerophospholipids (GPL) occur in three subclasses, depending on whether the hydrophobic chain that is linked to the sn-1 position of the glycerol backbone is an ester-bound fatty acid, an ether-bound fatty alcohol, or an alkenyl-ether-bound fatty aldehyde, the sn-2 position being occupied by a fatty acid (the phosphatidyl-, plasmanyl- or plasmenyl- GPL subclasses, respectively). In the class of triglycerides (TG), it is possible to find similar subclasses: the well-known triacylglycerols (TAG), with three fatty acids ester-bound to glycerol, and the etherlinked triglycerides (EL-TG), namely TG with a fatty acohol or a fatty aldehyde at the sn-1 position of glycerol, and fatty acids at the sn-2 and sn-3 positions (1-O-alky- or 1- O-alk-1’-enyl-, 2,3-diacyl-sn-glycerols, here abbreviated as alkyl-DAG and alkenyl- DAG, respectively). The knowledge about the characteristics of GPL and TG subclasses and their possible metabolic relationships in animal tissues and cells is at present scarce and fragmentary, especially regarding the EL-TG. The aim of this work was to gather information about the biochemistry of these subclasses, covering aspects of their levels and composition in different areas of the male reproductive system. Taking the rat as a model, in the testis and the epididymis the changes in these subclasses were studied during the postnatal development and, in the adult, the effects induced by heat stress. In spermatozoa, the distribution between head and tail of GPL subclasses, and the effects on the latter of the in vitro-induced capacitation and acrosome reaction were investigated. During postnatal development, the testicular content of all subclasses of choline and ethanolamine glycerophospholipids (CGP and EGP, respectively) increased, with a concomitant enrichment in 20 to 24 carbon atom polyunsaturated fatty acids (PUFA). As the postnatal age increased, in all of them the proportion of arachidonic acid (20:4n- 6) was reduced while that of docosapentaenoic acid (22:5n-6) increased. In adulthood the two plasmalogens, especially plasmenylethanolamine, were very rich in 22:5n-6. Similar increases in the percentage of 22:5n-6 was observed during pachytene spermatocytes differentiation into round spermatids, the 22:5n-6/20:4n-6 ratio being nearly 1:1 in phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine and a significantly higher ratio in the corresponding plasmalogens, especially plasmenylethanolamine. Both spermatogenic cells contained the 1-O-alkyl-GPL, plasmanylcholine and plasmanylethanolamine, the former being the potential precursor of the bioactive lipid PAF and the latter the metabolic precursor of plasmenylethanolamine. The EL-TG showed increases in their concentration per gram of tissue in two key stages of the first wave of spermatogenesis, postnatal days 21 and 45 (PN21 and PN45), when a considerable number of the first pachytene spermatocytes and the first round spermatids, respectively, are known to die by apoptosis. Transient and intermittent exposures of testicular tissue to hyperthermia (15 minutes to 43ºC, once a day during five consequently days) resulted in the selective loss of pachytene spermatocytes and early spermatids during the first 1-2 weeks after treatment, spermatogenesis restarting from the surviving spermatogonia afterwards. During this period, the numbers of germ cells and their characteristic lipids decreased, both increasing again with the recovery of spermatogenesis. The 20:4n-6-rich species of choline and ethanolamine GPL reappeared before those rich in 22:5n-6, just as it occurred during normal development, as spermatocytes reappeared before spermatids. During the first weeks post-treatment, when seminiferous tubules exhibited a profound loss of virtually all germ cell types with survival of Sertoli cells, the levels of TAG and TUE, and also of cholesterol esters, increased several fold, to decrease again afterwards. This transient accumulation was attributed to the phagocytic activity of Sertoli cells. In the epididymal tissue of adult rats, the three GPL subclasses were present. Regarding neutral lipids, in addition to large amounts of TAG, alkyl-DAG and alkenyl- DAG were found in significantly larger amounts than in testes. In both tissues, alkyl- DAG predominated over alkenyl DAG. Another notable difference with testes was that in epididymal lipids PUFA with 20 and 22 carbons of the n-6 series (20:4n-6, 22:5n-6) coexisted with PUFA of the n-9 series (22:3n-9, 22:4n-9). At postnatal day 30, in a scarcely differentiated epithelium and with no spermatozoa in its ducts, the epididymis contained higher levels of n-9 PUFA in plasmenylethanolamine than other subclasses. With the progress of development, these PUFA were increased in other subclasses, first in phosphatidylcholine (PN49 to 55) and then in plasmanyl- and plasmenylcholine (PN55 to adulthood). Regarding epididymal EL-TG, their levels increased significantly at PN49, coinciding with the fact that shortly before (PN45) a transient wave of germ cells from the testes had reached the epididymal tubules, being then replaced by the first spermatozoa. Because rat spermatozoa become progressively rich in plasmenylcholine with 22:4n-9 as they mature during their epididymal transit, we expected to find a greater concentration of this lipid in one of the epididymal segments, caput, corpus or cauda. However, in all the three regions the percentage of plasmenylethanolamine was higher than that of plasmenylcholine. The small corpus region was the one to exhibit the highest concentration (μg per gram of tissue) of plasmenylethanolamine and of its precursor, plasmanylethanolamine, in addition to alkyl-DAG and alkenyl-DAG, all of them rich in PUFA n-9. This suggested that the corpus plasmenyletanolamine could play a role as a precursor of the plasmenylcholine to be transferred to spermatozoa in transit. The possible mechanisms involved in these events are jet to be established. The effects of hyperthermia on the epididymis were very different from those described in the testis. The epididymal ducts progressively lost most of the spermatozoa that were originally present in their lumena in six weeks post-treatment, which agreed with the fact that epididymal lipids were depleted of 22:5n-6 and that 22:4n-6-rich plasmenycholine from cauda also decreased. However, the levels of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, and the corresponding plasmalogens of the caput region showed a significant buildup during the same period. Interestingly, the content per gram of tissue of alkyl-DAG and alkenyl-DAG increased sharply in the three epididymal regions (caput, corpus, cauda) during the first week post-hyperthermia and had decreased again at week 2, with an interesting divergence: in the case of species with n-6 PUFA, they continued to decline, but in the case of species with 18:1n-9 and n-9 PUFA from the caput region, they increased again by week six post treatment. Since the testicular tissue at this time (day 42 posthyperthermia) was still recovering, this increase could reflect a specific cellular response of the epididymal cells. Among these, the role of some cells of the mononuclear phagocytic system (dendritic cells, macrophages), which are normally present in the basal compartment of the epididymal epithelium, is worth investigating. In the adult animal in physiological conditions, the expression (mRNA) of alkylglycerone phosphate synthase (AGPS), a key peroxisomal enzyme involved in the synthesis of ether-linked lipids, was significantly lower in the testis than the epididymis. In the latter, AGPS was more actively expressed in the corpus than the caput, and in the latter the expression was greater than in the cauda. These findings demonstrated the importance of the first two epididymal segments in the biosynthesis of lipids with an ether linkage. Immediately after the last of the 5 episodes of hyperthermia, the mRNA expression significantly decreased in the testis, whereas in the epididymis remained unchanged. By contrast, at week 2 post-hyperthermia the level of mRNA of the enzyme in the testes had recovered, while in the caput and corpus epididymal segments was reduced. These results suggest that in the epididymis the presence of spermatozoa in the lumen is important for the enzymes involved in ether lipid biosynthesis to be expressed in the epithelial cells. In the first part of the third chapter, distribution between the sperm head and the sperm tail of CGP and EGP was determined. A novel finding was that, despite its small size, the head concentrated more of the total 22:4n-9-rich plasmenylcholine than the tail. The tail, in turn, contained more n-6 PUFA-rich phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine than the head. Remarkably, the sperm tail also contained n-6- PUFA-rich plasmanylcholine and plasmanylethanolamine. In the second part of this chapter, the involvement of the four major subclasses of sperm GPL in sperm capacitation and the acrosomal reaction was investigated. Compared to non-incubated controls, GPL hydrolysis of increasing intensity occurred in the following order: controls incubated with no additions, capacitated sperm, and capacitated sperm that had undergone the acrosomal reaction. Such hydrolysis was selective, as it increasingly affected, in that same order, the phosphatidyldholine and phosphatidylethanolamine subclasses. Thus these events, important for the function of spermatozoa, resulted in a relative enrichment in plasmalogens of the gametes. The results in this thesis opened new questions that will be the subject of future research on the biological role, properties, biosynthesis and catabolism of the GPL and TG with an ether bound in the reproductive tract cells.