Producción y caracterización molecular y funcional de ADN plasmídico para su utilización en el empaquetamiento de vectores lentivirales pseudotipados con la proteína S1 de SARSCov-2

Abstract

Este trabajo evaluó la obtención de ADN plasmídico mediante lisis alcalina y purificación por intercambio aniónico para su aplicación en el empaquetamiento lentiviral. Se analizó la integridad, identidad y calidad de las construcciones (plásmidos 16, 17, 18, 19, 65 y 97) utilizando electroforesis en gel de agarosa, mapeo por restricción enzimática y cuantificación espectrofotométrica. Los resultados confirmaron la obtención de ADN plasmídico íntegro en la mayoría de las preparaciones. El protocolo midiprep demostró ser superior al miniprep al reducir la presencia de ADN genómico residual. La identidad fue validada mediante el análisis de patrones de restricción, diseñados a partir de los modelos generados in silico. Se observaron variaciones en el rendimiento por un lado, y eficiencia de digestión en ciertas muestras, por otro. Esto podría haberse debido a factores como la variabilidad biológica del cultivo o posibles alteraciones en los sitios de restricción, siendo necesario el reprocesamiento del plásmido 17 debido a su baja calidad, por la degradación detectada. En conclusión, la metodología implementada permite producir ADN plasmídico con la calidad y pureza requeridas para ensayos posteriores. A pesar de la variabilidad observada entre preparaciones, los resultados validan la hipótesis de trabajo y demuestran la viabilidad técnica del protocolo para la producción de construcciones destinadas a la biotecnología viral.

This study evaluated the production of plasmid DNA by means of alkaline lysis and anion-exchange purification for use in lentiviral packaging. The integrity, identity, and quality of the constructs (plasmids 16, 17, 18, 19, 65, and 97) were analyzed using agarose gel electrophoresis, restriction enzyme mapping, and spectrophotometric quantification. The results confirmed the production of intact plasmid DNA in most preparations. The midiprep protocol proved superior to miniprep in reducing the presence of residual genomic DNA. Identity was validated by analyzing restriction patterns designed from in silico models. Variations in yield and digestion efficiency were observed in certain samples. This could have been due to factors such as the biological variability of the culture or possible alterations in the restriction sites, necessitating the reprocessing of plasmid 17 due to its low quality resulting from the detected degradation. In conclusion, the implemented methodology allows for the production of plasmid DNA with the quality and purity required for subsequent assays. Despite the variability observed between preparations, the results validate the working hypothesis and demonstrate the technical feasibility of the protocol for the production of constructs intended for viral biotechnology.