Estudio de la biología de HO-1 en el cáncer de tiroides

Abstract

El cáncer de tiroides (CT) constituye la neoplasia endocrina más común. La variante papilar representa la mayoría de los casos y suele ser curable en alrededor del 90% de los pacientes; sin embargo, en ciertos casos puede evolucionar hacia un carcinoma anaplásico, una forma altamente indiferenciada y de mal pronóstico. Este trabajo de tesis comenzó con el objetivo de contribuir a la identificación de nuevos marcadores tumorales en el CT, a fin de poder colaborar en el diagnóstico clínico de esta enfermedad ya que, en algunos casos, la histopatología de las muestras obtenidas por aguja fina no reproduce la evolución del paciente, llevando a veces a cirugías innecesarias. El Laboratorio de Biología del Cáncer ha demostrado el rol clave de la proteína hemoxigenasa-1 (HO-1) en la progresión de algunos tumores. Es por ello que hipotetizamos que también podría cumplir un rol en CT y que, incluso, podría utilizarse como marcador diagnóstico o de evolución de la enfermedad. Se organizó un grupo de trabajo con médicos del Servicio de cirugía de Cabeza y Cuello del Hospital Municipal “Dr. Leónidas Lucero”, con quienes se trabajó activamente a lo largo de todo el tiempo que llevó el desarrollo de esta tesis, resultando en un trabajo interdisciplinario muy enriquecedor. Así, este trabajo de tesis involucró investigaciones con muestras humanas y con líneas celulares de cáncer de tiroides. Los resultados obtenidos aportan información acerca del rol de hemoxigenasa-1 (HO-1) en este tipo de tumores e intenta comenzar a evaluar el potencial de HO-1 como marcador tumoral. En biopsias humanas de cáncer de tiroides demostramos que hay sobreexpresión de HO-1 y de su correspondiente ARNm, así como también que la proteína posee localización intracelular diferencial entre los tumores y los tejidos no malignos, siendo mayormente citoplasmática en los tumores y nuclear en los tejidos no malignos. Lamentablemente, el reducido número de muestras impidió establecer una correlación entre la localización de HO-1 y los parámetros clínico-patológicos de los pacientes. En líneas celulares en cultivo pudimos demostrar que la activación farmacológica indujo la expresión de HO-1 y produjo un aumento de la viabilidad celular, la migración y la formación de protrusiones celulares, además de la progresión del ciclo celular en las líneas celulares tumorales TPC-1 y 8505C. En cuanto a la localización subcelular pudimos detectar la expresión de la proteína tanto en el citoplasma como en el núcleo celular. En la línea celular no maligna Nthy- Ori-3-1, la activación farmacológica de HO-1 indujo su expresión y produjo una disminución de la viabilidad celular, mientras que no se observaron cambios en la migración celular y la formación de protrusiones. En contraposición a lo observado en los tejidos tiroideos, la localización subcelular de la proteína en esta línea fue citoplasmática. Por otro lado, la inhibición farmacológica de la actividad de HO-1 produjo una disminución de la viabilidad celular, de la migración y un arresto del ciclo celular en las líneas tumorales TPC-1 y 8505c, siendo la localización subcelular de la proteína citoplasmática. En la línea Nthy-Ori-3-1 la inhibición farmacológica de HO-1 tuvo los mismos resultados que en las líneas tumorales produciendo una disminución de la viabilidad celular y la migración, siendo la localización de la proteína también citoplasmática. Dado que la inhibición farmacológica de HO-1 induce su expresión, al igual que lo que ocurre con su activación farmacológica, esto demuestra que los efectos sobre los procesos celulares estudiados no se deben al aumento de los niveles proteicos de HO-1 o, si lo hacen, dependen de su localización subcelular. Además, estudiamos los efectos de la modulación de HO-1 sobre la vía de las MAPK y demostramos que la expresión de HO-1 induce la fosforilación de ERK, demostrando una posible relación entre dichas vías moleculares. Dado que la localización nuclear de HO-1 depende de su clivaje por ciertas cistein-proteasas, utilizamos un inhibidor de las mismas a fin de estudiar si se revertía el efecto de la activación farmacológica de HO-1 cuando esta no podía traslocar a núcleo. Efectivamente, al inhibir la traslocación de HO-1 al núcleo celular disminuyó la viabilidad celular, lo que indicaría la importancia de la localización subcelular de HO-1 para sus efectos sobre la progresión tumoral. Con el fin de descartar efectos de los moduladores de la actividad de HO-1 independientes de la misma y para profundizar en el rol de la actividad y la localización intracelular de HO-1, se realizó la modulación genética de HO-1 nativa y sus variantes (truncada en el extremo C-terminal y enzimáticamente inactiva), confirmando los resultados obtenidos con la modulación farmacológica de la proteína. La sobreexpresión de la proteína nativa y de la variante truncada (carente del extremo c-terminal por lo que transloca al núcleo celular) produjo un aumento de la viabilidad celular, la migración, la formación de protrusiones celulares y la disminución de la adhesión al sustrato promoviendo un fenotipo más agresivo. Estos procesos se produjeron en menor medida al sobreexpresar la variante enzimáticamente inactiva de la proteína. Estos resultados aportan evidencia de la participación de HO-1 en la progresión del CT y demuestran que tanto su localización subcelular como su actividad enzimática son necesarios para su actividad protumoral.

Thyroid cancer (TC) is the most common endocrine malignancy. The papillary variant accounts for the majority of cases and is usually curable in approximately 90% of patients; however, in certain cases it may progress to anaplastic carcinoma, a highly undifferentiated and aggressive form with poor prognosis. This thesis project began with the aim of contributing to the identification of new tumor markers in TC, in order to assist in the clinical diagnosis of this disease. This is particularly relevant as, in some cases, the histopathology of fine needle aspiration (FNA) samples does not reflect the patient's actual clinical outcome, sometimes leading to unnecessary surgeries. The Cancer Biology Laboratory has previously demonstrated the key role of the heme oxygenase-1 (HO-1) protein in the progression of certain tumors. Based on this, we hypothesized that HO-1 could also play a role in TC and might even be used as a diagnostic or prognostic marker. A collaborative team was formed with physicians from the Head and Neck Department of the “Dr. Leónidas Lucero” Municipal Hospital, with whom we worked closely throughout the development of this thesis, resulting in a highly enriching interdisciplinary collaboration. Thus, this thesis involved research using both human samples and thyroid cancer cell lines. The results obtained provide insight into the role of heme oxygenase-1 (HO-1) in this type of tumor and attempt to begin evaluating the potential of HO-1 as a tumor marker. In human TC biopsies, we demonstrated that HO-1 and its corresponding mRNA are overexpressed, and that the protein exhibits differential intracellular localization between tumors and non-malignant tissues—being predominantly cytoplasmic in tumors and nuclear in non-malignant tissues. Unfortunately, the small sample size prevented us from establishing a correlation between HO-1 localization and the patients' clinicopathological parameters. In cultured cell lines, we showed that pharmacological activation induced HO- 1 expression and led to increased cell viability, migration, protrusion formation, and cell cycle progression in the tumor cell lines TPC-1 and 8505C. Regarding subcellular localization, the protein was detected in both the cytoplasm and the nucleus. In the non-malignant cell line Nthy-Ori-3-1, pharmacological activation of HO-1 induced its expression and led to decreased cell viability, while no changes were observed in cell migration or protrusion formation. Unlike in thyroid tissues, HO-1 localization in this cell line was cytoplasmic. On the other hand, pharmacological inhibition of HO-1 activity reduced cell viability, migration, and induced cell cycle arrest in the tumor lines TPC-1 and 8505C, with the protein being localized in the cytoplasm. In the Nthy-Ori-3-1 cell line, pharmacological inhibition of HO-1 had similar effects, decreasing both viability and migration, with cytoplasmic localization of the protein as well. Since pharmacological inhibition of HO-1 also induces its expression, similar to pharmacological activation, these results indicate that the observed effects on cellular processes are not due to increased protein levels per se but rather depend on its subcellular localization. Furthermore, we studied the effects of HO-1 modulation on the MAPK pathway and showed that HO-1 expression induces ERK phosphorylation, suggesting a possible link between these molecular pathways. Because the nuclear localization of HO-1 depends on cleavage by specific cysteine proteases, we used an inhibitor of these proteases to assess whether blocking HO- 1 nuclear translocation would reverse the effects of its pharmacological activation. Indeed, when nuclear translocation of HO-1 was inhibited, cell viability decreased, suggesting that subcellular localization is crucial for HO-1's effects on tumor progression. To rule out HO-1–independent effects of the pharmacological modulators and to further investigate the roles of HO-1 activity and intracellular localization, we genetically modulated native HO-1 and its variants (a C-terminal–truncated form and an enzymatically inactive form). This confirmed the results obtained through pharmacological modulation. Overexpression of the native and truncated (nuclear- translocating) forms of HO-1 led to increased cell viability, migration, protrusion formation, and decreased substrate adhesion, promoting a more aggressive phenotype. These effects were less pronounced upon overexpression of the enzymatically inactive variant. Taken together, these results provide evidence for HO-1’s involvement in TC progression and demonstrate that both its subcellular localization and enzymatic activity are required for its pro-tumoral function.