Nanoformulaciones de aceites esenciales para el control de insectos plaga de productos almacenados

Abstract

La infestación por insectos plaga es una de las causas principales de pérdidas cuantitativas y cualitativas en el área de productos alimenticios almacenados (granos y productos derivados), tanto por sus daños directos como los indirectos. Los gorgojos Sitophilus oryzae L. (Coleoptera, Curculionidae) y Lasioderma serricorne F. (Coleoptera, Anobiidae) son dos de los principales protagonistas en el ataque de alimentos durante las fases de producción o en las subsiguientes etapas de distribución y almacenamiento. Entre las prácticas comunes para prevenir su infestación, se incluyen el empleo diversos insecticidas sintéticos. Sin embargo, el uso excesivo de estos productos ha provocado el recrudecimiento de la resistencia en insectos plaga, problemas en la salud humana y efectos adversos en el medio ambiente y en organismos no blanco. En este sentido, los bioinsecticidas basados en aceites esenciales (AEs) se muestran como una alternativa segura, de bajo costo y ambientalmente viable. En el presente trabajo se propuso desarrollar nanopartículas poliméricas (NPs) cargadas con AEs y evaluar los efectos letales y subletales en S. oryzae y L. serricorne y determinar su perfil ecotoxicológicos al investigar sus efectos en organismos no blanco acuáticos (Artemia salina L. (Anostraca, Artemiidae), terrestres (Tenebrio molitor L. (Coleoptera, Tenebrionidae) y Blaptica dubia Serville (Blattodea, Blaberidae) y en células de mamíferos del tipo osteoblástico. En consecuencia, se evaluó la actividad insecticida de los AEs de menta (Mentha piperita L. - Lamiaceae), palmarosa (Cymbopogon martinii (Roxb.) Wats - Poaceae), geranio (Geranium maculatum L. - Geraniaceae), lavanda (Lavandula angustifolia Mill. - Lamiaceae), orégano (Origanum vulgare L. - Lamiaceae), laurel (Laurus nobilis L. - Lauraceae) y árbol de té (Malaleuca alternifolia Maiden y Betche - Myrtaceae). En primera instancia, por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) se obtuvo la composición química de los AEs, en la cual se observó que en la mayoría de los casos los componentes mayoritarios fueron los monoterpenos (≈60%) y sesquiterpenos (≈30%), seguidos de hidrocarburos aromáticos, ácidos carboxílicos y derivados (≈5-10%). En cuanto a la actividad insecticida por exposición a

superficies tratadas, se observó que en S. oryzae los aceites de geranio y palmarosa fueron los más efectivos, mientras que en L. serricorne, el AE de palmarosa fue el que generó la mayor actividad. Por exposición a vapores, en S. oryzae, el aceite de árbol de té fue el que produjo mayor toxicidad y en L. serricone, el AE de geranio. Además, se estudió el efecto combinado de un insecticida sintético con los AEs, observándose que en S. oryzae, la combinación β cipermetrina y los AEs de geranio, palmarosa, orégano y laurel tuvo mayor efecto tóxico respecto a los compuestos individuales; en L. serricorne, la combinación de β-cipermetrina y los AEs de menta, lavanda y orégano fue más efectiva que la aplicación de los compuestos libres. A través del método de fusión-dispersión se obtuvieron las NPs de PEG-6000 cargadas con AEs con un rango de tamaños entre 191 y 534 nm, siendo las NPs cargadas con aceite de palmarosa, árbol de té, geranio y orégano las más pequeñas. El análisis del índice de polidispersión (IPD) indicó que las NPs de palmarosa, geranio, orégano y laurel fueron monodispersas (IPD<0,25), las NPs de lavanda y árbol de té tuvieron una distribución variable de tamaños (0,25<IPD<0,4), mientras que las NPs de menta fueron polidispersas (IPD>0,4). Con respecto a la eficiencia de cargado (EC), todas las NPs tuvieron una EC>70%. Las NPs de palmarosa, geranio, orégano, laurel y árbol de té mostraron una EC cercana al 90%, mientras que las NPs de menta y lavanda con valores de EC cercanos al 75%. Un total de 29 componentes fueron identificados por CG-EM en la fase éter de extracción de las NPs poliméricas, reconociéndose monoterpenos (≈73%), sesquiterpenos (≈21%) e hidrocarburos aromáticos (≈7%). En cuanto a la actividad insecticida de las NPs, por exposición a superficies tratadas, en S. oryzae, las NPs cargadas con aceite de orégano fueron las más efectivas, potenciando la toxicidad del aceite 7,51 veces; en L. serricone, las NPs elaboradas con los aceites de orégano y geranio fueron las que promovieron mayor toxicidad, potenciando la bioactividad de los AEs 3,58 y 3,30 veces, respectivamente. Cabe resaltar que las NPs de orégano fueron 2 veces más tóxica que el insecticida piretroide. En cuanto a la actividad por exposición a vapores, ninguna de las NPs generó toxicidad en S. oryzae y L. serricorne. Los porcentajes de mortalidad luego de la

exposición a una combinación de β-cipermetrina y las NPs mostró que en S. oryzae, la combinación del insecticida con las NPs de palmarosa, geranio, orégano, lavanda y laurel fueron más efectivas que los productos aplicados individualmente; para L. serricorne, este efecto fue corroborado con la combinación del insecticida y de las NPs de menta, palmarosa, geranio y orégano. En cuanto a los efectos subletales, las NPs potenciaron la actividad repelente de los AEs, siendo las formuladas con los aceites de menta, palmarosa (72 h) y orégano (60 h) las más efectivas en S. oryzae y L. serricorne. Además, se evaluaron los efectos conductuales de los AEs y sus NPs en ambos insectos, por medio del estudio de variables como la distancia total recorrida y velocidad (de 0 a 96 horas pos-tratamiento). En S. oryzae, los AEs de geranio y árbol de té y sus NPs fueron los más efectivos al modificar las variables hasta las 48 y 72 h post-tratamiento. En L. serricorne, los AEs de geranio, lavanda, orégano, laurel y árbol de té modificaron las variables durante 24 h, mientras que las NPs de geranio, lavanda, orégano y árbol de té extendieron sus efectos hasta las 48 y 72 h post-tratamiento. Por otro lado, los AEs y sus NPs modificaron los índices nutricionales de ambos insectos luego de 72 h de exposición. Los AEs de geranio y orégano y sus NPs fueron las que produjeron mayores alteraciones al disminuir los índices TCR, TRC y ECAI. Con el objetivo de obtener valores de referencia sobre la toxicidad de los AEs y sus NPs en ambiente acuáticos, se seleccionó al insecto plaga de interés sanitario Culex pipiens pipiens L. (Diptera, Culicidae) como representante de este tipo de medio. Tales valores fueron utilizados para comparar los efectos de estos productos sobre A. salina. En larvas IV de Cx. p. pipiens los AEs de orégano y laurel y las NPs de geranio y orégano fueron selectivas para este organismo. Se demostró que los AEs y sus NPs fueron ligeramente tóxicas en A. salina, específicamente, los AEs y sus NPs tuvieron valores de CL50 en un rango entre 11,38 y 77,37 ppm siendo las NPs de árbol de té el tratamiento con mayor efecto tóxico (11,38 ppm). Además, los AEs y sus NPs, demostraron ser prácticamente no tóxicos para larvas de T. molitor y ninfas de B. dubia, por lo tanto, resultan ser un producto seguro para su aplicación en ambientes terrestres. Con respecto

a los estudios relacionados con las células de mamíferos de tipo osteoblástico, ninguna de las NPs produjo citotoxicidad luego de 24 h de exposición; mientras que a las 48 h solo las NPs de geranio y árbol de té fueron citotóxicas. Cabe destacar que a las 72 h las NPs de geranio revertieron el efecto mencionado mientras que las elaboradas con el aceite de árbol de té lo acentuaron.

Infestation by insect pest is one of the main causes of qualitative and quantitative losses in the stored food area (cereals and cereal products), due to both direct and indirect damage. The weevils such as Sitophilus oryzae L. (Coleoptera, Curculionidae) and Lasioderma serricorne F. (Coleoptera, Anobiidae) are two of the most common species, which infest food during production or in the subsequent stages of distribution and storage. Traditional methods to prevent their infestation include the use of several synthetic insecticides. However, the overuse of these products has led to an increase of pest resistance, human health problems, and harmful effects on the environment and non-target organism. In this sense, bioinsecticides based on essential oils (EOs) are a safe, cost effective and ecofriendly alternative. In the present work, it was proposed to develop polymeric nanoparticles (PNs) loaded with EOs and evaluate their lethal and sublethal effects against S. oryzae and L. serricorne. Moreover, the ecotoxicological profile of the PNs was evaluated on aquatic (Artemia salina (L.)) and terrestrial (Tenebrio molitor (L.) and Blaptica dubia (Serville)) non-target organisms and mammalian osteoblast cell. The insecticidal activity of peppermint (Mentha piperita L. - Lamiaceae), palmarosa (Cymbopogon martinii (Roxb.) Wats - Poaceae), geranium (Geranium maculatum L. - Geraniaceae), lavender (Lavandula angustifolia Mill. - Lamiaceae), oregano (Origanum vulgare L. - Lamiaceae), laurel (Laurus nobilis L. - Lauraceae) and tea tree (Malaleuca alternifolia Maiden and Betche- Myrtaceae) EOs was evaluated. First, gas chromatography/mass spectrometry (GC MS) was used to determine the chemical composition of the EOs. Generally, the main compounds of these oils were monoterpenes (≈60%) and sesquiterpenes (≈30%), followed by aromatic hydrocarbons and carboxylic acids and their derivatives (≈5-10%). In the bioassay by exposure to treated surface, geranium and palmarosa EOs were the most effective on S. oryzae, while palmarosa EO had the strongest activity on L. serricorne. However, in the assay by vapors exposure, tea tree oil produced the highest toxicity on S. oryzae and geranium EO was the most toxic on L. serricorne. When the combination effect of β-

cypermethrin and EOs was studied, geranium, palmarosa, oregano or laurel EOs + β cypermethrin showed higher insecticidal activity than each individual oil on S. oryzae. On the other hand, on L. serricorne the combination of β-cypermethrin and peppermint, lavender or oregano was more effective than just the oils or the pyrethroid alone. The PNs of PEG-6000 loaded with EOs were prepared by melt-dispersion method. Their size ranged between 191 and 534 nm. Particularly the PNs of palmarosa, tea tree, geranium and oregano were the smallest. The polydispersity index (PDI) showed that the palmarosa, geranium, oregano and laurel PNs were monodisperse (PDI<0.25), the lavender and tea tree PNs had a variable size distribution (0.25<PDI<0.4), whereas peppermint PNs were polydispersed (PDI>0.4). According to loading efficiency (LE), the PNs presented LE values above 70%. The palmarosa, geranium, oregano, laurel and tea tree PNs had LE ≈90%, whereas peppermint and lavender PNs showed LE values of ≈75%. A total of 29 compounds were identified by GC-MS in the ether phase of PNs. These compounds were monoterpenes (≈73%), sesquiterpenes (≈21%) and aromatic hydrocarbons (≈7%). In bioassay by exposure to treated surface, PNs loaded with oregano EO were the most effective and increased 7.51 folds the insecticidal toxicity of the oil on S. oryzae; while on L. serricorne, oregano and geranium PNs showed the highest toxicity and enhanced the EOs bioactivity 3.58 and 3.30 folds respectively. It is important to emphasize, that oregano PNs was two times more toxic than the β-cypermethrin. In vapor exposure, the PNs haven’t shown insecticidal activity on S. oryzae and L. serricorne. In addition, on S. oryzae, the combination of β-cypermethrin and palmarosa, geranium, oregano, lavender or laurel PNs showed highest insecticidal activity than β-cypermethrin or PNs alone. However, on L. serricorne, peppermint, palmarosa, geranium or oregano PNs + β-cypermethrin were the most effective combinations. According to the sublethal effects, PNs enhanced the repellent activity of the EOs, and the most effective were peppermint, palmarosa (72 h) and oregano (60 h) PNs on S. oryzae and L. serricorne. In addition, the effects of EOs and their PNs on the behavior of both insects were

evaluated by measuring total distance and walking speed variable (0 to 96 h post-treatment). On S. oryzae, geranium and tea tree EOs and their PNs were the most effective and modified the variables up to 48 and 72 h post-treatment. On L. serricorne, geranium, lavender, oregano, laurel and tea tree EOs modified the variables for 24 h, whereas geranium, lavender, oregano and tea tree PNs extended behavioral effects up to 48 and 72 h post-treatment. On the other hand, the EOs and their PNs modified the nutritional physiology of both insects after 72 h of exposure. Geranium and oregano EOs and their PNs produced the most important change in nutritional physiology by decreasing RCR, RGR and ECI indices. To obtain reference valuesfor the toxicity of EOs and their PNs in the aquatic environment, Culex pipiens pipiens L. (Diptera, Culicidae) was selected as a model. These values were used to compare the effects of these products on A. salina. According to selective index, oregano and laurel EOs and geranium and oregano PNs showed more toxicity in the larvae IV of Cx. p. pipiens than A. salina. EOs and their PNs were slightly toxic to A. salina, specifically, the EOs and their PNs had LC50 values ranging from 11.38 to 77.37 ppm. Tea tree PNs was the treatment with strongest toxic effect (11.38 ppm). In addition, the EOs and their PNs were practically non-toxic to T. molitor larvae and B. dubia nymphs, making them safe for use in terrestrial environments. In mammalian osteoblast cells, the PNs showed not cytotoxicity after 24 h of exposure, while after 48 h only geranium and tea tree PNs were cytotoxic. It should be noted that after 72 h, geranium PNs reversed this effect, whereas tea tree PNs enhanced it.