Identificación y caracterización funcional de genes relacionados con la apomixis diplospórica en pasto llorón (Eragrostis curvula (Schrad.) Nees.)

Abstract

La especie Eragrostis curvula (Schrad.) Nees, comúnmente llamada pasto llorón, pertenece a la familia de las poaceas y es una forrajera naturalizada en la zona semiárida templada de Argentina, donde se la cultiva para alimentación del ganado. Esta gramínea comprende genotipos tanto diploides como poliploides, y estos últimos tienen la capacidad de reproducirse asexualmente mediante semillas, a través de un proceso denominado apomixis, que ha sido descripto en más de 400 especies de angiospermas y que conduce a la generación de progenie genéticamente idéntica a la planta madre. La apomixis no se encuentra presente en la mayoría de las especies de interés agronómico, como por ejemplo el trigo, el maíz o el arroz, por lo que el análisis del control genético y de expresión de este carácter es considerado de importancia para el desarrollo de herramientas para su transferencia a éstas y otras especies valiosas, y de esta manera conseguir la fijación de caracteres de valor agronómico a través de innumerables generaciones utilizando semillas. Por ello, el objetivo de esta Tesis se centró en analizar los mecanismos genéticos que subyacen en la reproducción apomíctica diplospórica presente en el pasto llorón. Inicialmente, a partir de inflorescencias de dos genotipos tetraploides de modo reproductivo contrastante, se generó un transcriptoma de referencia de la especie, utilizando la tecnología de pirosecuenciación Roche 454 y un ensamblado de novo de los transcriptos obtenidos, y se realizaron las validaciones in vitro en el marco de esta Tesis. La validación se llevó a cabo mediante cebadores específicos correspondientes a marcadores SSR, y se logró la correcta amplificación de un 83% de ellos, que en su gran mayoría presentaron los tamaños predichos in silico. Estos datos, junto con los análisis de alineamientos, demuestran un ensamblado de calidad del transcriptoma obtenido. Asimismo, se lograron validar fragmentos correspondientes a mRNAs hallados como diferencialmente expresados según el modo reproductivo. Luego, se llevó a cabo un análisis y caracterización de micro ARNs (miRNAs) diferenciales entre genotipos apomícticos y sexuales, así como también de sus ARN blancos, realizándose las validaciones correspondientes en el marco de este trabajo. Se generaron bibliotecas de miRNAs de genotipos contrastantes utilizando la tecnología Illumina, y se llevaron a cabo análisis de expresión diferencial. Se hallaron y validaron dos genes de importancia, cuya expresión se encontró relacionada a miRNAs específicos, y que se encontraron reprimidos en genotipos sexuales. Paralelamente, se unificó toda la información recolectada mediante el diseño de un microarreglo de ARN (Agilent), que fue hibridado utilizando ocho genotipos de E. curvula con reproducción contrastante. Mediante un análisis de expresión diferencial se logró obtener genes candidatos para la apomeiosis, que fueron analizados in silico, contrastándolos con bases de datos públicas y con el genoma de la especie. Se realizó entonces una validación molecular de estos genes mediante reacciones de PCR utilizando 14 genotipos, con una combinación de apomícticos y sexuales, asi como de distintas ploidías, y utilizando cebadores específicamente diseñados. Se observó que los genes de interés solo fueron amplificados en los genotipos apomícticos, estableciendo que se encuentran ausentes en todos los genotipos sexuales analizados, lo que se alinea con la teoría de que estos genes estarían relacionados de alguna manera con el modo reproductivo. Continuando con el objetivo de dilucidar la relación de estos genes con el carácter apomixis, se decidió utilizar la planta modelo Arabidopsis thaliana como receptor de los genes, generando vectores especializados para transformación vegetal e introduciéndolos en su genoma utilizando la técnica denominada floral dip y la bacteria Agrobacterium tumefaciens, con el fin de analizar la manifestación de cambios en el desarrollo sexual normal del óvulo en esta especie. Se generaron vectores a través de dos estrategias, Gateway y GoldenBraid, y se utilizaron promotores previamente descriptos cuya expresión había sido establecida en el óvulo y/o regiones cercanas. Los vectores fueron utilizados para transformar plantas de A. thaliana variedad Columbia 0, y las semillas obtenidas fueron seleccionadas en placas de Petri mediante el uso de antibióticos o herbicidas correspondientes a las resistencias utilizadas. Para el análisis de las plantas transformadas se realizaron ensayos moleculares, tanto genómicos como de expresión, acompañados de observaciones fenotípicas, llevadas a cabo en lupa y mediante microscopía DIC de tejido clarificado. Se logró observar óvulos y pistilos que presentaron fenotipos distintos a los observados en plantas salvajes, así como también un mayor número de abortos en algunas líneas, lo que pudo asociarse a la expresión de los genes en estudio en las líneas analizadas.

Eragrostis curvula (Schrad.) Nees, commonly known as weeping lovegrass, is a perennial grass from the Poaceae family, widely cultivated in the semiarid region of Argentina as a forage grass. E. curvula has a basic chromosome number of x = 10, and it includes genotypes with different ploidy levels. While the diploid cytotypes are scarce and sexual in nature, tetraploid plants and plants with higher ploidy levels reproduce by pseudogamous diplosporous apomixis, defined as asexual reproduction through seeds. Apomixis has been described in over 400 angiosperms, and it leads to the creation of clones of the mother plant. However, this attribute is absent in most species of agricultural importance. The study of the genetic regulation of this mechanism would be important for the development of tools that could enable its transference to key species, such as wheat, rice or maize, in order to fixate important agronomic traits through generations. The purpose of this work was focused on analyzing the genetic mechanisms that could play a role in diplosporic apomictic reproduction in weeping lovegrass. Initially, a reference transcriptome of the species was generated, from inflorescences of two tetraploid genotypes with contrasting reproductive mode, using Roche 454 technology and de novo assembly. The validation of the transcriptome, carried out within this Thesis, consisted in the analysis of SSR markers, where 83% of them were correctly amplified and most showed the length predicted in silico, indicating a high quality assembly. Also, differentialy expressed mRNAs were found, which were properly validated in vitro. Moreover, a characterization and analysis of differentially expressed miRNAs between apomictic and sexual genotypes was performed, studying also their target RNAs. Differential expression analyses were carried out from RNA libraries of contrasting varieties, that were generated using Illumina technology. The expression of two genes was associated to specific miRNAs, and they were found to be repressed in sexual genotypes. At the same time, an RNA microarray (Agilent) was designed to compile the sequence data obtained. This array was hybridized with E. curvula genotypes showing contrasting reproduction. A subsequent differential expression analysis found a small number of candidate genes for apomeiosis, that were contrasted with public databases and with the E. curvula genome. The validation and characterization of this genes were carried out by PCR and RT-PCR reactions, using 14 contrasting varieties with different ploidy. Amplification was only obtained in the apomictic genotypes, suggesting a potential involvement of these genes in the reproductive mode. Continuing with the main goal of elucidating the relationship between the obtained genes and apomixis, it was decided to use the model plant Arabidopsis thaliana (Columbia 0) as a receptor of the genes, generating specific constructs for the transformation via Agrobacterium tumafaciens, and using the floral dip method. Two strategies were implemented for the generation of the vectors, Gateway and GoldenBraid, and the chosen promoters were previously reported to be expressed in the ovule. The seeds obtained from the transgenic plants were subsequently selected and analyzed using a stereoscopic microscope and DIC microscopy, as well as PCR and RT-PCR reactions with specific primers. Some of the ovules and pistils showed phenotypes that differed from those expected in wild type plants, as well as showing an elevated number of abortions for some of the lines generated.