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dc.contributor.advisorMateos, Melina Valeria
dc.contributor.authorTenconi, Paula Estefanía
dc.contributor.otherGiusto, Norma María
dc.date2020-04-07
dc.date.accessioned2020-09-16T23:31:38Z
dc.date.available2020-09-16T23:31:38Z
dc.date.issued2020
dc.identifier.other2020-1731es
dc.identifier.urihttp://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/5214
dc.description.abstractLa inflamación es un factor clave en la patogénesis de diversas enfermedades de la retina que eventualmente terminan en la pérdida de la visión y ceguera, tales como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la retinopatía diabética (RD), endolftalmitis bacteriana y la uveítis. En este contexto, las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) son esenciales para mantener la integridad estructural y funcional de la retina y se ha demostrado que, en estas condiciones patológicas, el EPR puede mediar importantes funciones inmunológicas y participar activamente de la respuesta inflamatoria. El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue dilucidar los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR. En particular nos propusimos estudiar el rol de la vía de la fosfolipasa D (PLD), generadora de mensajeros lipídicos, en dos modelos de injuria inflamatoria: i) inducida por lipopolisacárido (LPS) y ii) por altas concentraciones de glucosa (HG), a modo de simular las hiperglucemias características de la diabetes. En el desarrollo de esta tesis utilizamos dos líneas celulares de EPR de origen humano, las líneas ARPE-19 y D407. Las PLD clásicas hidrolizan fosfatidilcolina (PC) para generar un segundo mensajero lipídico, el ácido fosfatídico (PA) y colina. El PA puede desfosforilarse por las lípido fosfato fosfohidrolasas (LPP) para generar diacilglicerol (DAG), otro lípido bioactivo. Por lo tanto, la vía de PLD/LPP puede modular la actividad de las proteínas que responden al DAG, como las proteínas quinasas C (PKC) y también de proteínas que son moduladas por el PA, como mTOR (del inglés, mammalian target of rapamycin), entre otras. Resultados previos de nuestro laboratorio habían demostrado la activación de la vía PLD y la participación de las isoformas clásicas (PLD1 y PLD2) en la respuesta inflamatoria de las células del EPR expuestas a LPS. En el capítulo I estudiamos el rol de la vía PLD en la activación de la señalización por PKC en las células del EPR expuestas a LPS. Demostramos que ambas PLD clásicas son necesarias para la activación de isoformas convencionales de PKC (α y βII), mientras que la activación de la isoforma novel PKCε solo es dependiente de la PLD1. Evidenciamos además que la PKCε media la supervivencia de las células del EPR expuestas al LPS promoviendo una menor activación de la caspasa-3 y aumentando la expresión de Bcl-2 y la activación de Akt. Por otra parte, las PKCα y β no estarían involucradas en la pérdida de la viabilidad inducida por el LPS. En conclusión, la vía PLD1-PKCε media la supervivencia de las células del EPR previniendo las señales apoptóticas inducidas por el LPS. En el capítulo II caracterizamos el modelo de injuria celular inducido por HG. La exposición de las células del EPR a HG indujo la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), la activación de la caspasa-3 y la disminución de la funcionalidad mitocondrial (parámetro de viabilidad celular). Demostramos además que los niveles elevados de glucosa inducen en las células del EPR la activación temprana y concatenada de la vía PLD y de la quinasa regulada por factores extracelulares (ERK1/2), la fosforilación del inhibidor de κB (IκB) y la activación del factor de transcripción nuclear κB (NFκB). La activación del NFκB inducida por la HG se correlacionó con el incremento en la expresión de los ARNm de interleuquinas (IL) proinflamatorias (IL-6, IL-8) y de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Finalmente, demostramos que en las células del EPR expuestas a HG los inhibidores farmacológicos de PLD1 (VU0359595) y de PLD2 (VU0285655-1) previenen la expresión de los mediadores proinflamatorios, la activación de la caspasa-3 y la reducción en la viabilidad celular. Los resultados obtenidos en las células expuestas a LPS y al modelo de injuria inducida por HG demuestran que el rol de las PLD en las células del EPR difiere según cuál sea el origen de la injuria inflamatoria. Estos hallazgos indican la importancia de conocer los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR desencadenada por distintos estímulos. Nuestros resultados postulan a las isoformas clásicas de PLD como posibles dianas terapéuticas para distintas enfermedades inflamatorias de la retina.es
dc.description.abstractInflammation is a key factor in the pathogenesis of several retinal diseases that eventually end in vision loss and blindness, such as age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy (DR), retinitis pigmentosa (RP) and uveitis. In this context, retinal pigment epithelial (RPE) cells are essential to maintain the integrity and function of the retina and it has been shown that, under these pathological conditions, RPE cells can mediate important immunological functions and actively participate in the inflammatory response. The main objective of this Ph. thesis was to elucidate the molecular mechanisms involved in the inflammatory response of the RPE. In particular, we wanted to study the role of the lipid messenger generating phospholipase D (PLD) pathway in two inflammatory injury models: i) induced by lipopolysaccharide (LPS) and ii) by high glucose (HG) concentrations, in order to simulate the typical hyperglycemia of diabetes. To this end, we used two human RPE cell lines: ARPE-19 and D407. Classical PLDs hydrolyze phosphatidylcholine (PC) to generate the lipid second messenger, phosphatidic acid (PA), and choline. PA can be further dephosphorylated by lipid phosphate phosphatases (LPP) in order to generate diacylglycerol (DAG), another lipid messenger. Thus, the PLD/LPP pathway can modulate the activity of DAG-responding proteins, such as protein kinases C (PKCs) and PA-responding proteins such as mTOR (mammalian target of rapamycin), among others. Previous results from our laboratory demonstrated the activation of the PLD pathway and the participation of classical PLD isoforms (PLD1 and PLD2) in the inflammatory response of RPE cells exposed to LPS. In the first chapter of this thesis, we studied the role of the PLD pathway in the activation of LPS-induced PKC signaling in RPE cells. We demonstrated that both PLDs are necessary for the activation of conventional PKC isoforms (PKCα/βII) while the activation of the novel PKCε is dependent only on PLD1. We also showed that PKCε mediates the survival of RPE cells exposed to LPS by promoting less activation of caspase-3 and increasing Bcl-2 expression and activation of Akt. In contrast, PKCα and β may not be involved in the cell viability loss induced by LPS. In conclusion, the PLD1-PKCε pathway mediates RPE cell survival by preventing apoptotic signals induced by LPS. In chapter II we characterized the model of cellular injury induced by HG. RPE cell exposure to HG induced reactive oxygen species (ROS) generation, caspase-3 activation and reduced mitochondrial functionality (cell viability parameter). We also demonstrated that in RPE cells high glucose levels induce the early and concatenated activation of the PLD pathway and of extracellular signal regulated kinase (ERK1/2), the phosphorylation of inhibitor of κB (IκB) and the activation of nuclear factor κB (NFκB). The activation NFκB induced by HG was found to correlate with the increased expression of proinflammatory interleukins (IL-6, IL-8) and cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNA. Finally, we demonstrated that in RPE cells exposed to HG pharmacologycal inhibitors of PLD1 (VU0359595) and PLD2 (VU0285655-1) prevent the expression of proinflammation mediators, the activation of caspase-3 and the reduction in cell viability. The results obtained in RPE cells exposed to LPS and in the model of cellular injury induced by HG demonstrate that the role of PLD isoforms in RPE cells differs depending on the origin of the inflammatory injury. These findings indicate the importance of knowing the molecular mechanisms involved in the RPE inflammatory response elicited by different stimuli. Our results postulate classical PLD isoforms as possible therapeutic targets for several retinal inflammatory diseases.es
dc.description.abstractTEXTO PARCIAL en período de teletrabajo
dc.formatapplication/pdfes
dc.format.extentvi, 135 p.es
dc.language.isospaes
dc.rightsReconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 (CC BY-NC-ND 4.0)es
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/es
dc.subjectBioquímicaes
dc.subjectRetinopatía diabéticaes
dc.subjectInflamaciónes
dc.titleLa vía de la fosfolipasa D en las células del epitelio pigmentario de la retina : su rol en la patogénesis de la retinopatía diabética y otras enfermedades inflamatorias de la retinaes
dc.typetesis doctorales
bcuns.collection.nameBiblioteca Digital Académicaes
bcuns.collection.acronymBDAes
bcuns.collection.urlhttp://tesis.uns.edu.ar/es
bcuns.collection.institutionBiblioteca Central de la Universidad Nacional del Sures
bcuns.depositorylibrary.nameBiblioteca Central de la Universidad Nacional del Sures
bcuns.author.affiliationUniversidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmaciaes
bcuns.author.affiliationConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas - Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blancaes
bcuns.advisor.affiliationConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas - Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blancaes
bcuns.defense.cityBahía Blancaes
bcuns.defense.provinceBuenos Aireses
bcuns.defense.countryArgentinaes
bcuns.programme.nameDoctorado en Bioquímicaes
bcuns.programme.departmentDepartamento de Biología, Bioquímica y Farmaciaes
bcuns.thesisdegree.nameDoctor en Bioquímicaes
bcuns.thesisdegree.grantorUniversidad Nacional del Sures
uns.type.publicationVersionacceptedes
bcuns.contributorother.affiliationConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas - Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blancaes
bcuns.depositarylibrary.acronymEUNes
bcuns.subject.keywordsFosfolipasa Des
bcuns.subject.keywordsCélulas del epitelio pigmentario de la retinaes
bcuns.subject.keywordsEnfermedades inflamatorias de la retinaes
dcterms.accessRights.openAireinfo:eu-repo/semantics/openAccesses
bcuns.contributorotheraffiliation.acronymUNSes
bcuns.contributorotheraffiliation.acronymCONICET-INIBIBBes
bcuns.contributorotheraffiliation.countryArgentinaes


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