17ß-estradiol promueve la sobrevida del músculo esquelético : mitocondria como blanco estrogénico, acción antipoptótica y vías de señalización intracelular

Abstract

El 17β-estradiol, una hormona clásicamente asociada a funciones reproductivas, ha adquirido trascendencia por sus efectos en varios tejidos no asociados a la reproducción. Asimismo, se ha propuesto que el 17β-estradiol contribuiría a la supervivencia celular en varios tejidos. En músculo esquelético ha sido descripta la presencia de receptores de estrógenos (ER) aunque el mecanismo molecular activado por la hormona y el rol fisiológico de la misma en este tejido no han sido totalmente dilucidados. En este laboratorio, utilizando la línea celular de músculo esquelético murino C2C12 se demostró que, sumado a la localización citosólica-nuclear, los ER se encuentran en mitocondria y fracción microsomal. En esta tesis, se investigó el rol del 17β-estradiol sobre las cascadas de señalización que se activan durante la apoptosis en mioblastos esqueléticos, caracterizando los mecanismos moleculares involucrados y enfatizando sobre la modulación de funciones mitocondriales. Los estudios realizados sugieren que la inducción de apoptosis con H2O2 en células C2C12 activa diferentes vías de señalización que incluyen la fosforilación temprana de PKD, y posteriormente las de JNK, PKCδ, PKCθ, p53 y p66Shc, efectos que son revertidos con el pretratamiento con 17β-estradiol. En particular, PKCδ actúa upstream JNK que, a su vez, conduce a la fosforilación y translocación mitocondrial de p66Shc en respuesta al H2O2. Este efecto también es contrarrestado por 17β-estradiol, resultando en la protección del potencial de membrana mitocondrial y la prevención de la apertura prolongada del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial. Esta acción protectora del 17β-estradiol sobre la fisiología mitocondrial también incluye la inhibición de la translocación de Bax hacia mitocondria. Asimismo, se observó que uno de los sucesos en el inicio de la apoptosis disparados por H2O2 es el aumento en la formación de estructuras tipo-TNT (tunneling nanotubes) entre las células para promover la transferencia de mitocondrias sanas desde las células no estresadas a las estresadas, mientras que el pretratamiento con la hormona disminuye su formación, efecto probablemente relacionado con la reducción en la proporción de células estresadas que necesitarían revertir la disfunción mitocondrial. Estas mitocondrias disfuncionales producen mayor cantidad de especies reactivas del oxígeno y cuando sus niveles aumentan, las enzimas antioxidantes son fundamentales para contrarrestar sus efectos negativos. En esta tesis se observó que la disminución de la capacidad antioxidante inducida por H2O2 es revertida por el pretratamiento con 17β-estradiol mediante la regulación de las actividades enzimáticas y/o expresión proteica de MnSOD, GPx y CAT a través de ERs. Por otra parte, se evidenció la regulación de FoxOs por 17β-estradiol que induciría la inhibición de la transcripción de genes proapoptóticos, y además que el inductor de apoptosis regula negativamente a nivel transcripcional a Bcl-2, y positivamente a p66Shc, PUMA y PERP, acciones que son revertidas por 17β- estradiol. Por otro lado, la regulación transcripcional de MDM2 por el H2O2, que involucra a ERK, se relacionaría con la actividad de p53 y FoxO3a inactivo. Esta tesis aporta conocimientos básicos sobre los mecanismos moleculares activados por 17β-estradiol frente a la apoptosis inducida por H2O2 en células musculares esqueléticas que resultan en supervivencia celular.

17β-estradiol, a hormone typically associated with reproductive functions, has gained significance for its effects on several tissues not associated with reproduction. Furthermore, it has been proposed that 17β-estradiol contributes to cell survival in various tissues. In skeletal muscle it has been described the presence of estrogen receptors (ER) but the molecular mechanism activated by the hormone and its physiological role over this tissue have not been fully elucidated. In this laboratory, using the murine skeletal muscle cell line C2C12 it was shown that, in addition to the cytosolic-nuclear localization, the ER was found in mitochondria and microsomal fraction. In this thesis, it was investigated the role of 17β-estradiol on the signaling cascades that are activated during apoptosis in skeletal myoblasts, characterizing the molecular mechanisms involved and emphasizing on modulation of mitochondrial functions. The studies suggest that induction of apoptosis with H2O2 in C2C12 cells activates different signaling pathways including early phosphorylation of PKD, and then the phosphorylation of JNK, PKCδ, PKCθ, p53 and p66Shc, effects that are reversed by pretreatment with 17β-estradiol. In particular, PKCδ acts upstream JNK which, in turn, leads to phosphorylation and mitochondrial translocation of p66Shc in response to H2O2. This effect is counteracted by 17β-estradiol, resulting in the protection of mitochondrial membrane potential and prevention of sustained opening of the mitochondrial permeability transition pore. This protective effect of 17β-estradiol on mitochondrial physiology also includes the inhibition of Bax translocation to mitochondria. It was also observed that one of the events in the beginning of apoptosis triggered by H2O2 is an augmented formation of TNT-like structures (tunneling nanotubes) between cells that promotes the transfer of healthy mitochondria from unstressed to stressed cells, whereas pretreatment with the hormone decreases its formation, effects that would probably be related to the reduction in the proportion of stressed cells that needs to reverse mitochondrial dysfunction. Since dysfunctional mitochondria produce more reactive oxygen species, when their levels are increased, antioxidant enzymes are essential to counteract their negative effects. In this thesis, it was observed that the decrease in H2O2-induced antioxidant capacity is reversed by pretreatment with 17β-estradiol by regulating enzyme activities and/or protein expression of MnSOD, GPx and CAT via ERs. Additionally, it was observed that the regulation of FoxOs mediated by 17β- estradiol would be related to the inhibition of transcription of proapoptotic genes, and moreover that the apoptotic inductor negatively regulates the transcriptional level of Bcl-2, and positively the transcriptional levels of p66Shc, PUMA and PERP. These actions are reversed by pretreatment with 17β-estradiol. Also, it was suggested that the transcriptional regulation of MDM2 by H2O2 involved ERK and that it could be related to p53 activity and inactive FoxO3a. This thesis provides basic information on the 17β-estradiol-activated mechanisms against H2O2-induced apoptosis in skeletal muscle cells resulting in cell survival molecular mechanisms.