Estudio y caracterización de la fosfolipasa C específica para fosfatidilcolina (PC-PLC) en el sistema nervioso central

Abstract

La fosfatidilcolina (PC) es uno de los glicerofosfolípidos más abundantes en las membranas celulares y es además fuente de segundos mensajeros lipídicos tales como el diacilglicerol (DAG), el ácido fosfatídico (PA), el ácido araquidónico (AA) y la lisofosfatidilcolina (LPC). Por su parte, el DAG es capaz de mediar eventos celulares claves a través de la regulación de diversas proteínas entre las que encontramos: las proteínas quinasas C (PKC), las proteínas quinasas D (PKD), las quimerinas, las proteínas liberadoras de nucleótidos de guanina de Ras (RasGRPs), las Munc13s y las DAG quinasas (DAGK). Estos efectores del DAG participan en funciones celulares como la fusión y el tráfico de las membranas, la inflamación, la proliferación, la diferenciación y la muerte celular. La generación de DAG por hidrólisis de la PC se produce en respuesta a diversos estímulos celulares y es catalizada principalmente por la acción de dos vías enzimáticas: por la activación de la fosfolipasa D (PLD) (enzima que genera PA, el cual es hidrolizado a DAG por la acción de una fosfatasa de ácido fosfatídico tipo 2 o PAP2) y por la reacción catalizada por la fosfolipasa C específica para PC (PC-PLC) la cual genera DAG y fosfocolina. Los principales objetivos de la presente tesis doctoral fueron demostrar la presencia de la vía de la PC-PLC en las terminales sinápticas (sinaptosomas) de la corteza cerebral de rata y estudiar el efecto del estrés oxidativo en la generación de DAG a partir de la PC. Los resultados de esta tesis fueron divididos en dos capítulos, en la primera parte estudiamos la presencia de la PC-PLC en los sinaptosomas de ratas adultas y seniles y realizamos la caracterización de esta actividad enzimática. En los sinaptosomas (Syn) de ratas adultas los agentes tensioactivos Triton X-100 y deoxicolato de sodio (DOC) estimularon la formación del DAG observándose la máxima generación en presencia de Triton X-100 al 0,1%, concentración que incrementó la generación de DAG en un 330% con respecto al control. Por otra parte, el agregado de los iones Ca2+ (2 mM) y Mg2+ (1 mM) exógenos inhibió la formación de DAG en un 73% y en un 50% respectivamente. En presencia de etanol (2%) evaluamos la reacción de transfosfatidilación catalizada por la PLD por la cual se genera fosfatidiletanol (PEth) en lugar de PA. Dado que la PAP2 no puede hidrolizar el PEth al incluir este alcohol primario en la reacción enzimática pudimos medir la generación de DAG que proviene exclusivamente de la vía de la PC-PLC. Mediante la utilización de etanol, del inhibidor de la PC-PLC (D609) y del DL-propranolol como inhibidor de la PAP2, demostramos que ambas vías enzimáticas (PC-PLC y PLD) participan en la generación de DAG. Luego de 20 min de incubación la vía de la PLD aportó el 40% del DAG generado mientras que la PC-PLC fue responsable del 60% del DAG generado. Este mismo aporte porcentual se observó en los sinaptosomas provenientes de ratas seniles. Los ensayos cinéticos realizados en presencia de etanol permitieron determinar la constante aparente de Michaelis-Menten (KM) y velocidad máxima (Vmáx) para la PC-PLC sinaptosomal, las cuales fueron de 350 μM y 3.7 nmol DAG x (mg proteína x h)-1 respectivamente. Ensayos de Western blot utilizando un suero policlonal anti-PC-PLC de Bacillus cereus evidenciaron la presencia de dos bandas muy próximas, de un peso molecular cercano a 66 kDa, tanto en las terminales sinápticas de ratas adultas como de ratas seniles. La generación de DAG se evaluó en la fracción de membrana plasmática sinaptosomal (SPM), en esta fracción la formación de DAG fue un 73% mayor respecto a la generación en los sinaptosomas mientras que en la fracción soluble la hidrólisis de la PC a DAG fue prácticamente indetectable. Mediante la utilización de etanol demostramos que la actividad específica de la PC-PLC es un 80% mayor en la fracción SPM que en los Syn. Estudiamos también la hidrólisis de la PC en la fracción de membrana resistente a detergentes (DRMs). Esta fracción (aislada por el tratamiento de los Syn de ratas adultas y seniles con Triton X-100 1% a 4C) presentó características de rafts de membrana, ya que se encontró enriquecida en esfingomielina y colesterol, así como también en proteínas marcadoras de rafts como la caveolina y c-Src. La fracción DRM presentó además un perfil proteico diferencial al de los Syn y un enriquecimiento en la isoforma PLD1, mientras que ensayos de Slot blot mostraron que la PC-PLC se localiza en ambas fracciones. También en las DRMs se observó la generación de DAG por hidrólisis de la PC, sin embargo la presencia de etanol en el ensayo no disminuyó la formación de DAG. Estos resultados indicaron que, a pesar de encontrarse enriquecida en la isoforma PLD1, no se detectó actividad de la PLD en la fracción resistente a detergentes. Por el contrario, la actividad de la PC-PLC fue aproximadamente un 60% mayor en las DRMs con respecto a los Syn. En la segunda parte de la tesis estudiamos el efecto del estrés oxidativo inducido por Fe2+ en la hidrólisis de la PC. La incubación de los Syn de ratas adultas con FeSO4 (50μM) generó un marcado aumento en la peroxidación lipídica que se observó a partir de tiempos cortos de incubación. También se afectó la funcionalidad mitocondrial y la integridad de la membrana plasmática, aunque estos dos parámetros se vieron afectados luego de 60 min de incubación con el agente inductor de la injuria oxidativa. El tratamiento de los Syn de ratas adultas con el hierro provocó una mayor generación de DAG por hidrólisis de la PC, este aumento fue del 77, 50 y 65% luego de 5, 30 y 60 min de preincubación respectivamente. En forma contraria, la generación de ácidos grasos libres (AGL) se inhibió en un 50% luego de 5 y de 60 min de preincubación con el hierro. Evaluando la generación de DAG en presencia de etanol (actividad de la PC-PLC) y la formación de PEth como marcador de la actividad de la PLD, demostramos que ambas vías enzimáticas contribuyen a la formación de DAG bajo condiciones de estrés oxidativo. El mismo efecto en la generación de DAG y AGL se observó en las terminales sinápticas de ratas seniles. Tampoco se observaron diferencias en los niveles de peroxidación lipídica en los Syn de ratas seniles con respecto a las adultas. La generación de DAG en los Syn de ratas adultas fue independiente de la activación de la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y de la actividad de tirosinas quinasas. Por otra parte, la inhibición de la fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2-PLC) disminuyó significativamente la generación de DAG en los Syn expuestos al Fe2+, sin embargo este efecto no fue mediado por la actividad de las PKCs. La inhibición de las vías metabolizadoras, DAGK y DAG lipasa (DAGL), tampoco modificó los niveles de DAG generados tanto en la condición control como en la experimental, esto se observó en los Syn de ratas adultas y seniles. En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez la presencia de la PC-PLC en las terminales sinápticas de la corteza cerebral de rata. Nuestros hallazgos constituyen el primer indicio acerca de la activación de las vías de la PC-PLC y de la PLD en condiciones de estrés oxidativo en las terminales sinápticas, representando el punto de partida para el estudio del rol de estas vías de generación de segundos mensajeros lipídicos en los procesos neurodegenerativos.

Phosphatidylcholine (PC) is one of the most abundant glycerophospholipids in cellular membranes and is also the source of second lipid messengers such as diacylglycerol (DAG), phosphatidic acid (PA), arachidonic acid (AA) and lyso phosphatidylcholine (LPC). DAG can mediate key cellular events through the regulation of several proteins such as protein kinase C (PKC), protein kinase D (PKD), chimaerins, Ras guanine-releasing protein (RasGRP), Munc13 and DAG kinase (DAGK). These DAG-regulated proteins participate in cellular functions such as membrane fusion and traffic, inflammation, proliferation, differentiation and cell death. In response to several stimuli, DAG generation through PC hydrolysis can be catalyzed mainly by two enzyme pathways, namely by means of the activation of phospholipase D (PLD, which yields PA which is, in turn, hydrolyzed to DAG by a phosphatidic acid phosphatase type 2 or PAP2) or by means of the action of a PC-specific phospholipase C (PC-PLC) that generates DAG and phophocholine. In view of the above, the main objectives of this thesis were to demonstrate the presence of the PC-PLC pathway in rat cerebral cortex synaptic endings (synaptosomes) and to study the effect of oxidative stress on DAG generation from PC. The results collected were divided into two chapters. Chapter I focuses on the presence of PC-PLC in synaptosomes from adult and aged rats and it includes the characterization of this enzyme activity. It was observed that in synaptosomes (Syn) from adult rats the tensioactive agents Triton X-100 and sodium deoxycholate (DOC) stimulated DAG generation which was highest in the presence of 0.1 % Triton X-100. This concentration enhanced DAG formation by 330% with respect to the control condition. Furthermore, the addition of Ca2+ (2 mM) and Mg2+ (1 mM) decreased DAG generation by 73% and 50%, respectively. In the presence of ethanol (2%) we evaluated the transphosphatidylation reaction produced by PLD which generates phosphatidylethanol (PEth) instead of PA. Under this condition DAG generation was evaluated exclusively from PC-PLC because PEth cannot be hydrolyzed by PAP2. The use of ethanol, PC-PLC inhibitor (D609) and DL-propranolol as PAP2 inhibitor, allowed us to demonstrate that both enzyme pathways (PC-PLC and PLD) participate in DAG generation. After 20 min of incubation PLD pathway generated 40% of total DAG whereas PC PLC generated the remaining 60%. The same contribution was observed in synaptosomes from aged rats. Kinetic studies carried out in the presence of ethanol showed a KM and Vmax values for the synaptosomal PC-PLC of 350 μM and 3.7 nmol DAG x (mg protein x h)-1, respectively. Western blot analysis using an anti-PC-PLC polyclonal antibody raised against Bacillus cereus PC-PLC showed two bands with a molecular weight close to 66 kDa in synaptic endings from adult and aged rats. DAG generation was evaluated in the synaptosomal plasma membrane fraction (SPM). In this fraction DAG generation was increased by 73% with respect to that in synaptosomes. In addition, PC hydrolysis to DAG was negligible in the soluble fraction. By using ethanol it was possible to demonstrate that PC-PLC specific activity was increased by 80% in the SPM fraction with respect to Syn. We also studied PC hydrolysis in the detergent resistant membrane fraction (DRMs). This fraction, which was isolated by treating Syn of adult and aged rats with 1% Triton X-100 at 4C, evidenced characteristics similar to those of rafts, as it was enriched in sphingomyelin and cholesterol as well as in raft marker proteins such as caveolin and c-Src. The DRM fraction also showed a different protein profile from that of Syn. DRMs were also enriched in PLD1 while Slot blot assays showed that PC-PLC was located in Syn and DRM fractions. DAG formation from PC was also observed in DRMs. However, in this fraction the presence of ethanol did not decrease DAG formation. These results indicated that, despite being enriched in PLD1, PLD activity was not detected in DRM fraction. In contrast, PC-PLC activity was 60% higher in DRMs with respect to Syn. Chapter II of this thesis deals with the effect of Fe2+-induced oxidative stress on PC hydrolysis. The incubation of adult rat Syn with FeSO4 (50μM) generated a marked increase in lipid peroxidation which could be observed after short incubation times. Mitochondrial viability and plasma membrane integrity were also affected although these parameters were affected with the oxidative stress inductor after 60 min of incubbtfznÐßKn ulwE 4W#Sv{ E gï erb*was stimulated by FeSO4 (50 μM) after 5, 30 and 60 min of incubation by 77, 50 and 65%, respectively. On the other hand, free fatty acid (FFA) generation was inhibited by 50% after 5 and 60 min of incubation with iron. By measuring DAG generation in the presence of ethanol and PEth formation as a marker of PLD activity, we demonstrated that both enzyme pathways contribute to DAG formation under oxidative stress conditions. The same effect on DAG and FFA formation was observed in synaptic endings from aged rats. No differences in lipid peroxidation levels were observed in aged rats Syn with respect to adult rats. DAG generation in Syn from adult rats was independent of tyrosine kinases activity and of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway. On the other hand, the inhibition of phosphatidylinositol bisphosphate-specific phospholipase C (PIP2-PLC) decreased DAG formation in Syn exposed to Fe2+. However this effect was not mediated by PKC. The inhibition of metabolizing pathways (DAGK and DAG lipase) did not modify DAG levels generated under control and experimental conditjoaf;ÞjisRas# Vved in Syn from adult and aged rats. In conclussion our results demonstrated for the first time the presence of PC-PLC in rat cerebral corte{ |lnfwicàndjkWadpnÞslgeûMer/E58findings constitute the first evidence of PC-PLC and PLC activation in Syn under oxidative stress conditions and represent the starting point for further studies aimed at understanding the role of lipid second messengers in neurodegenerative events.